《水稻转基因方法及培养基配放个》由会员分享，可在线阅读，更多相关《水稻转基因方法及培养基配放个（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含 2%活性氯含量的 NaClO 溶液（加1-3 滴 Tween20）浸泡 30min 以上（最长可至 1 小时左右） ，并不断摇动，然后用无菌水冲洗 4-5 次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于 N2D6 培养基上，于 24-26 C 暗培养 7-10 天，诱导出初生愈伤组织； 将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有 50mg/mL km 的 LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28 C 培养 36
2、h。挑取活化的单个农杆菌菌落，在 28 C 于 3mL 含 km 的 LB 培养基中振荡培养过夜，第 2 天按 1.5/50（V/V）接种量在 AB 液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600 约为 0.6-0.8 ） 。离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约 1/2-1/3 体积的 AAM（含 100-400molL-1 乙酰丁香酮）液体培养基中，至 OD600 约为 0.8-1.0 左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的 AAM 重悬液中，浸泡 15-20 分钟，并不断摇动。将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C 上培养 3 天（26
3、C，暗培养） 。转入筛选培养基 N6D2S1 上与 24-26 C 暗培养条件下筛选 2 周。新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基 N6D2S2 上，继续筛选培养 2 次，每次 2 周。将抗性愈伤组织转入 MSPR 培养基上进行预分化处理 14 天，其中先在暗条件下培养 7 天，然后转入光条件下培养 7 天；经预分化处理的愈伤组织转入 MSR 培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0 培养基上生根壮苗。农杆菌介导转化水稻所用培养基N6D2 N6（chu,1978）盐分和维生素，0.5gL -1 酪蛋白水解物（sigma） ，30gL-1 蔗糖， 2mgL-1 2,
4、4-D,2.5gL -1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1 N6D2，25mgL -1 潮霉素 B（Roche） ，500mgL -1 头孢霉素（cefotaxime） N6D2S2 N6D2，50mgL -1 潮霉素 B，300mg/mL 头孢霉素 与农杆菌的共培养AB 3gL-1K2HPO4, 1gL-1NaH2PO4, 1gL-1NH4Cl, 300mgL-1MgSO47H2O, 150mgL-1 KCl, 10mgL-1CaCl2, 2.5mgL-1FeSO47H2O, 5gL-1 葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama 和 Hinata， 1985）
5、盐分和氨基酸，MS （Murashige 和Skoog 1962）维生素，0.5gL -1 酪蛋白水解物，36gL -1 葡萄糖，68.5gL-1 蔗糖， 100-400molL-1 乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10gL-1 葡萄糖，100-400molL -1 乙酰丁香酮（用时现加） ，pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige 和 Shog，1962）盐分和维生素，0.5gL -1 酪蛋白水解物，50gL -1 蔗糖，2mgL -16-BA，1mgL -1NAA, 5mgL-1ABA ，3.0gL -1 Phytagel, pH 5.8，50mgL -1
6、 潮霉素 B，200mgL -1 头孢霉素。MSR MS( Murashige 和 Shog，1962) 盐分和维生素，0.5gL -1 酪蛋白水解物，30gL-1 蔗糖，2mgL -1 6-BA，0.5mgL -1 NAA, 0.5mgL-1KT, 3.0gL-1Phytagel, pH5.8 , 50mgL-1 潮霉素 B，200mgL -1 头孢霉素再生小苗生根壮苗1/2MS0 1/2MS(Murashige 和 Shog，1962) 盐分， MS 维生素，30 gL -1 蔗糖，1mgL-1 多效唑（可不加） ，0.5mgL -1NAA, 50mgL-1 潮霉素，2.5gL -1Phytagel, pH5.8
