跨骨膜物质转运的成像与定量

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1、跨骨膜溶质转运的成像与定量：肌肉-骨骼串扰的含义ABSTRACT已经知道，肌肉和骨骼是一个功能单位，在组织的发育期和维持期中，在生物学上是有交互的。人们已经发现肌源性因子（肌因子 myokines）在活体中影响骨的功能。但是，局部肌肉骨骼串扰的一个关键步骤，肌因子穿入骨骼的转运时间（transport times） ，还没有被原位定量或活体定量。在本研究中，我们通过共聚焦显微镜对模拟肌因子的荧光示踪剂进行追踪和建模，研究了骨膜的渗透性，它是肌肉-骨骼串扰的主要屏障。通过反射光共聚焦成像和时间序列性 xz 共聚焦成像，我们分别在完整的小鼠胫骨中观察到了骨膜表面边界线，以及示踪剂穿入骨膜边界内的过

2、程。我们选择了四种荧光示踪剂，包括荧光素钠（376Da ） ，右旋糖酐（3kDa，10kDa，以及 40kDa） ，因为它们代表了肌因子分子量（MW）中很大一部分。我们发现：1）小鼠骨膜可以被三种示踪剂穿过，而 8 小时内有超过 40%的 40kDa 示踪剂无法穿过，提示骨膜是半透性的，其半透性的临界 MW 差不多是40kDa， 2）穿过骨膜（厚约 60m）的特征性穿入时间随示踪剂 MW 的增加而增加，符合这个公式：()=(4.43104)0.57(4104) 8.651084104)由这个公式，就可以推断出各种肌因子的特征性穿入时间。为了实现有效的肌肉-骨骼串扰，几种可能的信号通路应当具有穿

3、入时间比其生物活性时间短的特点，我们假定生物活性时间是其在体内分子半衰期的 5 倍。那么，预计诸如 PGE2，IGF-1 ，IL-15 和 FGF-2 这样的肌因子符合这个要求。总而言之，我们发展了一种新的成像方法，并用其研究了模拟肌因子的示踪剂穿过骨膜的过程，使得人们可以进行更深入的，生理学正常情况下和病理学条件下肌肉-骨骼交流的定量研究。Introduction不断出现的证据提示肌肉和骨骼是一个功能单位，在组织的发育期和维持期（1-3）相互交流。由骨骼肌分泌的可溶性因子（称为肌因子 myokines）可以影响骨的代谢（4-7） 。这些肌因子包括生长因子（例如，胰岛素样生长因子-1IGF-1

4、，成纤维生长因子-2FGF-2，以及转化生长因子 TGF-） ，细胞因子（例如，白细胞介素IL6 和 IL-5） ，以及其它小信号分子（例如，前列腺素 E2PGE2） 。近期一项研究显示了由骨骼肌分泌的肌因子通过活化Wnt/-联蛋白途径保护骨细胞免于皮质激素诱导的凋亡，这种保护作用在肌肉受电刺激时极大地增强（8） 。肌肉还可以充当细胞和生长因子的一个重要来源，能促进骨的愈合（9 ） ，而肌肉祖细胞甚至还保有分化到成骨细胞谱系的能力（10 ，11 ） 。在两个方向上都可以对骨和肌肉的交流进行操作。人们发现骨髓源性的间叶基质细胞（MSCs）可以通过释放生长因子刺激骨骼成肌细胞增殖（12） 。另外，

5、机械性刺激的 MLO-Y4 成骨细胞可以表达促合成因子，例如 IGF-1，血管内皮生长因子（VEGF ）或肝细胞生长因子（HGF ） ，已经知道这些因子影响肌肉的重量及其对机械负荷的适应能力（13） 。因此，理解肌肉和骨骼在功能上的相互作用对开发新的，高效的骨骼/肌肉恢复策略十分关键。骨膜是一层纤维膜，生理上将骨骼和肌肉组织分隔开来，既是肌/骨骼源性生长因子的功能目标，也是骨骼和肌肉之间溶质及液体交换的重要把门人（6，14） 。骨膜分为不同的两层，外面的纤维层含有成纤维细胞，胶原，Sharpey 纤维，以及大量的神经网和微血管网，内侧的形成层含有神经，毛细血管，以及成熟期间叶祖细胞（15-19

6、） 。作为多能间叶干细胞的储备池，形成层可以分化成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，以及骨骼肌细胞（20，21 ） ，骨膜是肌/骨骼源性生长因子的一个作用点。近期一项研究发现骨膜充当着肌因子 IGF-1 和IGF-2 的富余受体，已知这两个因子是骨形成的强力调控因子（6） 。此外，作为一个交界面，骨膜可以充当分子筛，控制着骨-肌肉串扰所涉及的各种信号因子的穿入和转运速率。到目前为止，骨膜被描述成从完全密封/不可渗透的液体融合屏障（22-25） ，到半透膜（26 ）的这样一类东西。最近一项研究用分离样本及达西定律（Darcys law）测出了山羊股骨和胫骨骨膜的液压电导。但是，骨膜对信号分子筛选的作用

7、还没有被原位确定过。为了填补骨膜渗透性这方面的知识空白，并进一步阐明肌肉和骨骼相互交流的机制，我们发展了一种新的方法，用共聚焦显微镜来量化分子原位穿过无活性的骨膜这一过程。通过反射光成像，首先识别出了小鼠的胫骨骨膜，然后短暂地（temporally）追踪了荧光示踪剂穿入骨膜的这一过程，从中得知了骨膜的筛子特性。在分子量和骨膜的特征性穿入时间之间建立了经验公式。这些数据帮助我们分析了骨骼-肌肉串扰中限制着速率的步骤，并分析了可能参与这种交流的分子。新的方法及定量数据奠定了从生理条件和病理条件进一步研究肌肉-骨骼相互作用的基础。Material and methods荧光示踪剂我们选用了四种荧光示

8、踪剂，包括荧光素钠（376Da, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO） ，以及额定分子量分别为 3kDa，10kDa，和 40kDa 的荧光素结合右旋糖酐（Molecular Probes/Invitrogen Corp., Eugene, OR）作为肌因子系列的代表。示踪剂溶液中示踪剂的浓度（荧光素钠是 0.01mg/mL，右旋糖酐是 0.02mg/mL）根据预实验的结果选定的，以确保：1）对发现骨膜中的示踪剂而言，荧光信号足够强；2 ）荧光的强度适合于示踪剂的浓度（不饱和，也不会因为密度过大而缺少荧光28 ） 。样本的制备用二氧化碳处死十二只骨骼上发育成熟的小鼠（C57

9、BL/6J 或 Balb/cJ，58 月龄） 。立即取出左胫骨，用外科剪小心地去除软组织和黏附组织，使骨膜在结构上保持无活性（Fig.1） 。偶然情况下，准备期间会发生骨膜穿孔。在示踪剂追踪 xz 成像中（后述） ，通过异常高浓度点在不同均一浓度的背景上显现出来，可以很容易的发现穿孔的情况。受损的样本被遗弃不用。样本在小鼠死亡后 3 小时内进行检验，以尽可能减少渗透性及其它死亡后的改变。对每种示踪剂，用 3 只小鼠来实验。所有用到动物的过程均经过 Delaware 大学动物使用与管理委员会批准。实验准备在（25 ）室温下，左胫骨的两个末端被刚性固定于特制的支架上，支架置于一个成像室中，成像室内

10、含有磷酸缓冲盐（PBS，120mL） （Fig.2A） 。距近端约 2030%处的胫骨柄前内侧骨膜表面用于实验（Fig.2B） 。选择这一区域的理由是：1 ）它相对较平，且在显微镜成像平面（xy ）的焦点上；2 ）局部示踪剂的穿入过程可以简化为一维（z ）数学问题，可忽略骨骼曲面的问题。在骨膜表面上确定我们感兴趣的那个区域后，我们用装有透镜逆变器（lens inverter，LSM 技术，Etters,PA ）和 201.0 数值孔径水浸透镜（WPlan-Apochromat, Zeiss）的反向激光扫描共聚焦显微镜（inverted confocal laser-scanning micro

11、scope, Zeiss LSM 510, Carl Zeiss Inc. Thornwood, NY）对骨进行成像（Fig.2A） 。 “L 形”的透镜逆变器改变了激光的方向，使得胫骨及其朝上的骨膜表面可以在顶部得以成像。骨膜的确认与识别为了识别胫骨骨膜的边界，在反射镜下的 xz 扫描捕获了这一图像，使用的是 512-像素的连续行扫描（a series of line scans） ，速率为 3.93 秒/ 行，聚焦平面在与骨膜表面垂直的 z方向上从浸泡液向内部的骨逐步移动（Fig.2C） 。一 z 步（z-step）选定为 1.19m。由于骨膜中致密结缔组织的存在，受激发的激光很容易反射，

12、然后通过反射模式，在 xz 扫描时可以收集到强信号。为了进一步确认 xz 反射成像中这一高强度层是骨膜，在另一个隔离实验中使用了针对胺类的组织染色。三根新鲜的，伴有无活性骨膜的游离胫骨，首先在使用488nm 激发态， 7.5%激光功率的反射光模式下成像，然后浸入溶有 Texas-red C2-二氯三嗪（2mg/mL）的 PBS 溶液中。这种活性染料的吸收/ 发射峰值约为 588/601nm，与骨膜已发现的蛋白质中含量丰富的氨基很快发生反应并结合。在染料浸泡 24 小时后，用 PBS 多次清洗半小时，以去除残留的染料溶液，然后通过使用 561nm 激发态波长（3%透射）的共聚焦显微镜成像。含有丰

13、富的蛋白质/胺的骨膜被 Texas-red C2-二氯三嗪染成红色（Fig.3B） 。在整个过程中，成像室中胫骨的位置和聚焦的区域都保持不变，所以红色荧光通道和反射光信号通道是重叠的，可以进行比较（Fig.3C） 。取得两个通道的经过标准化的空间光强度分布图（在后续“特征性示踪剂穿入时间”一节中详细介绍） 。我们的结果很清晰地提示用反射光成像识别骨膜有很高的精确度（Fig.3C,3D） 。从空间光强度分布图中（约 100z 步）可以看出，两种方法测定的骨膜边界（垂直红线）都位于最大光强度值一半处（红色水平虚线，Fig.3D） ，从最大光强度处计算两个边界间骨膜的厚度。这些边界值也用到了示踪剂穿

14、入过程的时间连续性成像上，以确定转运的各种特征（后文详述） 。示踪剂穿入过程的时间连续性成像在对示踪剂穿入骨膜这一过程成像之前，已经用之前“样本准备”中所述的方法游离出了胫骨，然后用反射光成像确定了骨膜。然后从成像室中移除 PBS 浸泡液，用两支 60mL的注射器向成像室中加入一种预混荧光示踪溶液（120mL） 。更换液体的步骤十分小心，以避免震动和/或干扰到了成像系统，并且这一过程很快（约数秒） ，以尽可能减少干燥，干燥会改变骨膜的渗透性。将示踪剂溶液引入成像室后，立即开始沿骨膜深部进行连续的 xz扫描。对荧光素钠和右旋糖酐，分别使用功率为 5.5%和 7.5%的 488nm 激光。扫描行的

15、长度为 256 像素， z 步定为 6.15m。单次含有 30z 步的 xz 扫描耗时一般约 7 秒。xz 扫描不断重复，多达 400 次，在这一过程中追踪示踪剂穿入骨膜的过程，时间长达 8 小时。示踪剂穿越骨膜过程中代表性的快照，用 ImageJ 软件包（NIH）按照不同的时间点进行了分类（Fig.4） 。特征性示踪剂穿入时间为了量化和比较不同示踪剂穿入的过程，我们从每一次时间连续性扫描中得到了一个特征性的转运时间。首先，对不同时间点的二维 xz 扫描图像，通过将其 x 维 256 个像素上的光信号强度平均一下，使其坍缩为一维光信号强度的分布图，然后用浸泡溶液中荧光强度对强度分布图进行标准化

16、。每次测试，都如前所述用反射光成像识别出浸泡液-骨膜和骨膜-骨的交界面（ Fig.3D） ，并用于示踪剂穿入分布图中，在穿入分布图中，浸泡液的交界面被定为 z=0，骨的交界面被定为 z=1（Fig.5A） 。其次，每个时间点的穿入深度（垂直红线d1 和 d2）被定为示踪剂信号强度达到标准化示踪剂信号强度一半时（红色虚线，Fig.5A）所示的深度。最后，从各个按时间分类的数据组中获取穿入深度，进行比较并写进穿入时间函数，在穿入时间函数中，特征性穿入时间（t c）被定义为穿入深度从 0 到骨膜中间平面（z=0.5 处的红色水平线，Fig.5B）所需的时间间隔。示踪剂穿入骨膜的有效转运速率为了进一步量化转运动态过程，我们从空间时间分布图（Fig.5A）中计算出骨膜-溶液表面（z=0）的转运特征。计算出每个时间点上交界面的浓度梯度（C/z） 。作为初步近似处理，我们假定流经交界面的液体遵从 Fick 定律，并与浓度梯度和转运速率常数