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1、丁酸钠和丙酸钠对工程 CHO 细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响*马军董艳秋邹珉程联胜刘兢*（中国科学技术大学生命科学学院合肥 230027）摘要抗 p185 erbB2 基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗 p185 嵌合抗体的重组工程 CHO 细胞株为对象，分别用不同浓度丁酸钠（02mmol/L）和丙酸钠 (010mmol/L) 对处在对数生长期的细胞进行处理，在连续 5d 的培养过程中，每隔 24h 取样测活细胞数量，并用 ELISA 检测上清中抗体含量，5d 后结束培养用 FACS 检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至 90满度的细胞，然后每隔 12h 取样一次检测
2、葡萄糖和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程 CHO 细胞中的表达，表达量最高时可达 58.359.6mg/L，是对照组的 1.5 倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在 G1 期，并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比，丙酸钠具有较小的细胞毒性，是一种有潜力的替代品。关键词丁酸钠丙酸钠 CHO 细胞嵌合抗体收稿日期：20050429 修回日期：20050712* 国家“863”计划资助项目(2004AA215260)* 通讯作者，电子信箱：jliu CHO 细胞的蛋白表达加工能力较强，因而常用来表达外源重组蛋白。有研究表明，一种小分子短链脂肪酸丁酸
3、钠可以提高多种外源蛋白在 CHO 细胞中的表达量，比如凝血因子1 、组织纤溶酶原激活物(t-PA)2 、促红细胞生成素(EPO)3 、人血小板生成素(hTPO)4及一氧化氮合成酶(NOS)5等。表达量提高的程度因表达产物的不同而有差异。同时研究还显示丁酸钠可以抑制细胞生长,阻断细胞周期，诱导细胞凋亡等。另有报道，同属于短链脂肪酸的丙酸钠也可以提高 CHO 细胞中外源蛋白的表达量,比如因子6和胰蛋白酶抑制因子(AAT)7 。p185 是由癌基因 HER-2/ebB2 编码的分子量为 185kDa 跨膜蛋白，属表皮生长因子受体家族。一些肿瘤患者，尤其是乳腺癌患者，被发现存在有 p185 的过度表达
4、8 。1998 年美国Genetech 公司研发出第一个人源化的抗 p185 工程抗体药物Herceptin，并经 FDA 批准投入临床应用，用于治疗 p185 高表达的乳腺癌。抗体药物开始成为生物制药中一个引人注目的发展方向，但由于抗体药物临床治疗剂量较大，如何高效表达抗体就成了一个重要的研发环节。本实验室在自主研制的抗 p185 单克隆抗体的基础上，构建了一个分泌型 muScFvhuFc 人鼠嵌合抗体，体内外活性检测显示其具有良好的肿瘤细胞生长抑制活性。通过在 CHOGS表达系统下逐步加压反复筛选，得到一株稳定表达嵌合抗体的工程细胞株,表达量为57mg/d/106 细胞9,10 。本实验中
5、我们用不同浓度的丁酸钠和丙酸钠对此工程细胞株进行处理，在有血清的培养条件下观察和比较它们对细胞生长代谢和嵌合抗体表达量的影响，为优化大规模制备抗体工艺进行了探索。1 材料与方法 1.1 细胞株与细胞培养稳定分泌表达抗 p185 的人鼠嵌合抗体的工程 CHO 细胞株由本实验室构建9,10 。工程 CHO 细胞株常规培养在 100ml Flask（Nunc 公司产品）瓶中，置于 37，5CO2 及一定湿度的培养箱中，培养基成分如下：不含谷氨酰胺的 DMEM 培养基（GIBCO 公司产品）添加 5透析过的（v/v）的胎牛血清（杭州四季清公司产品）和 1（v/v）的非必需氨基酸（GIBCO 公司产品）
6、以及各 600mg/L 的谷氨酸和天冬氨酸,各 35mg/L 的核苷酸（腺苷酸，鸟苷酸，胞苷酸，尿苷酸，胸苷酸） 。2005, 25(10)马军 等：丁酸钠和丙酸钠对工程 CHO 细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.10 20051.2 丁酸钠或丙酸钠处理一定量的丁酸钠和丙酸钠（Sigma 公司产品）溶于 PBS 中配成浓度分别为 1mol/L 的贮液，0.22m 膜（millipore 公司产品）滤过后保存于 4冰箱。细胞按以下方法处理：(1)5105 个细胞接种于 100ml flask 瓶中，第二天贴壁后换成新配制
7、的含不同浓度丁酸钠（0,0.2,0.5,1,2 mmol/L）或丙酸钠（0,1,3,6,10 mmol/L）的培养基，按不同浓度各分 5 组，每组 15 瓶，以后每隔 24h 每种浓度各取 3 瓶进行细胞计数和表达量测定并取平均值，5d 后结束时检测细胞周期。(2)5105 个细胞接种于 100ml Flask 瓶中，长至 90满度后，实验组换成新配制的含 1mmol/L 的丁酸钠或 6mmol/L 的丙酸钠的培养基,对照组也同时换液但不予添加丁酸钠或丙酸钠，每种浓度设 3 个平行对照，以后每隔 12h 各取微量上清进行葡萄糖和乳酸分析并取平均值。1.3 细胞计数0.25胰酶(GIBCO 公司
8、产品)消化细胞后，台盼蓝染色，在显微镜下用细胞计数板对活细胞进行计数。 1.4FACS 分析细胞周期细胞消化后按每 1106 个/管悬浮于 200l PBS 中，加入 2ml 70 预冷的乙醇固定30min，再将细胞离心重悬于 500l 含 40g/ml 的碘化吡啶(PI)和 100g/ml 的 RNA 酶（均为 Sigma 公司产品）的 PBS 中，37温育 30min 后 FACS 仪（BD 公司产品）检测各组样品 DNA 的含量变化，并由此分析丁酸钠和丙酸钠处理对细胞周期变化的影响。为了减少误差，所有样品都收集固定后一同测定。1.5 抗体表达量的 ELISA 检测上清中的嵌合抗体含量用夹
9、心 ELISA 法测定，以羊抗人 Fc 多抗（Fizegiald 公司产品）铺板（F96,Nunc 公司产品） ，以 HRP 标记的羊抗人 Fc 多抗（Pirece 公司产品）为标记多抗，OPD 进行显色反应后在 490nm 波长下用酶标仪（BIO-TEC 公司产品）检测吸光值。抗体浓度用 IgG1 标准梯度对照（Sigma 公司产品）来确定。1.6 葡萄糖/乳酸代谢分析上清中的葡萄糖/乳酸含量分别用 GOD-PAP 法葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛公司产品)和乳酸脱氢酶法乳酸检测试剂盒（南京建成公司产品）测定。2 结果与分析 2.1 丁酸钠、丙酸钠对细胞生长的影响用不同浓度的丁酸钠或丙酸钠处理细
10、胞后，每 24h 取样进行计数，绘制出细胞生长曲线。由图 1A 可以看出：丁酸钠对 CHO 细胞的生长有明显的抑制作用，这种抑制作用与其浓度成正比。丙酸钠也有相似的作用（图 1B） ，但与丁酸钠不同的是，丙酸钠对细胞生长影响较小。2.2 丁酸钠、丙酸钠对细胞周期的影响用流式细胞仪对连续培养 5d 后的细胞进行 DNA 含量分析，由图 2 可以看出：随着丁酸钠浓度的升高，处在 G1 期的细胞的比例不断增加，由对照组的 44增加到 73。丙酸钠虽然对细胞周期也有阻断作用，但效果较弱。和图 1 相对照,随着细胞生长抑制的增强，G1 期细胞比例也相应增加。因此细胞被阻断在 G1/S 交界处，可能是细胞
11、生长抑制的主要原因之一。2.3 丁酸钠、丙酸钠对抗体表达量的影响实验结果由图 3 可以看出：工程 CHO 细胞的嵌合抗体累积表达量随着丁酸钠浓度的提高而不同程度的增加，当达到 1mmol/L 时效果最佳，是对照组的 1.5 倍，但是浓度继续增加表达量反而会下降(图 3A)。这可能是更高浓度的丁酸钠有过强的细胞生长抑制作用而导致细胞总数过少所致。丙酸钠的促表达作用虽然较丁酸钠弱，但是提高丙酸钠的浓度可以达到和丁酸钠相同的效果(图 3B)。值得注意的是：虽然 6mmol/L 丙酸钠对提高抗体表达量的效果与 1mmol/L 丁酸钠相当，但两者对细胞生长的抑制作用并不一致，后者对细胞生长的抑制作用明显
12、比前者强。2.4 丁酸钠、丙酸钠对葡萄糖/乳酸代谢的影响分别选用促蛋白表达效果相近的 1mmol/L 的丁酸钠和 6mmol/L 的丙酸钠对长至 90密度的工程细胞进行处理，此时细胞基本长满后进入稳定期，数量变化不大，可以减少细胞数差异带来的误差。每隔 12h 取样检测，结果见图 4：丁酸钠，丙酸钠可以减少葡萄糖的消耗，抑制乳酸的生成，其中以丁酸钠的效果为强。我们还观察到在整个培养过程中，与添加了一定量的丁酸钠或丙酸钠的细胞组相比，对照组的 pH 变化较为剧烈，细胞易于脱落，状态较差。图 1 不同浓度的丁酸钠(A)和丙酸钠(B)培养液对重组 CHO 细胞生长的影响Fig. 1Growth pr
13、ofiles of recombinant CHO cells cultured in different concentration of sodium butyrate (A)and sodium propionate (B)图 2 不同浓度的丁酸钠(B,C,D)和丙酸钠(E,F,G)处理对重组 CHO 细胞周期的 DNA 含量的影响对照为不加处理(A)Fig. 2DNA contents histograms from recombinant CHO cells grown in different concentration ofsodium butyrate (B,C,D) and
14、propionate (E,F,G)图 3 不同浓度的丁酸钠(A)和丙酸钠(B)处理重组 CHO 细胞对嵌合抗体表达产量的影响Fig. 3Chimeric antibody production of recombinant CHO cells treated with different concentrationof sodium butyrate (A) and propionate (B) quantitated by ELISA图 4 丁酸钠和丙酸钠处理对葡萄糖钠消耗和乳糖积累细胞代谢的影响Fig. 4Glucose consumption and lactate accumulat
15、ionafter by recombinant CHO cellstreatments withsodium butyrate and propionate.3 讨论丁酸钠可以促进多种外源蛋白在 CHO 细胞中的表达。对于不同的表达产物和细胞株，丁酸钠的效果和最佳浓度也有差异15 。有研究表明，这与丁酸钠可以抑制组蛋白的磷酸化并诱导其超乙酰化，促进组蛋白和 DNA 解离，降低 RNA 合成酶的空间位阻，加速 mRNA的合成等有关11 。Steve 等12认为，处在 G1 期的杂交瘤细胞可以更有效地分泌 Mab, 因此丁酸钠的促表达效果与其阻断细胞周期在 G1 期有关。通过用另外一种短链脂肪酸丙
16、酸钠对工程 CHO 细胞进行平行处理和比较，我们发现其与丁酸钠有着相似的效果，所以可能也是通过类似的机理发挥作用的。在实际的生产中应该综合考虑其对细胞的影响，权衡利弊。细胞培养的早期，细胞生长如果受到抑制则会延长细胞生长时间，影响细胞总量；但是在生产期，适当的抑制细胞生长却可以避免细胞过满。葡萄糖消耗和乳酸生成的减少则可以减少因葡萄糖消耗过快、pH 变化剧烈给细胞带来的不利影响，从而减慢细胞衰退，延长生产时间2 。此时用适当浓度的丁酸钠来提高嵌合抗体的表达量无疑是利大于弊的。一定浓度的丁酸钠还可能诱导细胞凋亡4 。我们在整个细胞培养的过程中并没有观察到明显的细胞凋亡，这可能是因为在有血清培养的条件下，02mmol/L 的丁酸钠还不足以引起工程 CHO 细胞的凋亡。Kim 等13用抗凋亡基因 Bcl2 转染表达人源化抗体的工程CHO 细胞株，从而有效地抑制在无血清培养条件下丁酸钠诱发的凋亡
