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1、伤寒 Vi 多糖疫苗4. 内容：4.1 产品名称及剂型4.1.1 产品名称：伤寒 Vi 多糖疫苗4.1.2 产品剂型：液体剂型剂型4.2 产品概述：本品系用伤寒沙门菌培养液纯化的 Vi 多糖，经用 PBS 稀释制成，不含防腐剂。用于预防伤寒。4.3 生产工艺流程图：菌种（Ty2 株 CMCC50098）传代（1 代、2 代）小罐液体培养大罐液体培养杀菌、去菌体、收集多糖纯 化除菌过滤原液检定稀 释半成品检定分 装成品检定包 装成 品4.4 生产、分包装和检定操作过程及工艺条件：4.4.1 菌种生产用菌种应符合中华人民共和国药典2010 年版三部中“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2、4.4.1.1 菌种名称生产用菌种为伤寒沙门菌 Ty2 株 CMCC50098。4.4.1.2 工作种子批的建立工作种子批菌种来源于主种子库菌种。主种子库菌种经开启，传代扩增后冻干，冻干菌种经检定合格后为工作种子批。4.4.1.2.1 主种子库菌种传代主代冻干菌种启开后传一代于肉汤琼脂培养基，3537培养 1620 小时；传二代于肉汤琼脂培养基，3537培养 1620 小时。4.4.1.2.2 工作种子批菌种的冻干制备生长良好的二代菌种，混悬于脱脂牛奶保护剂中冻干。4.4.1.2.3 工作种子批菌种的检定4.4.1.2.3.1 培养特性及染色镜检菌种接种于 pH7.27.4 的肉汤琼脂培养基
3、3537培养 1620 小时，应为无色半透明、边缘整齐、表面光滑湿润的圆形菌落。染色镜检应为革兰阴性杆菌。4.4.1.2.3.2 生化特性接种葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖于 3537培养 57 日，发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇（产酸不产气） ；不发酵乳糖、蔗糖（现行版中华人民共和国药典三部中附录） ；氧化酶试验阴性。4.4.1.2.3.3 血清学特性（1）玻片凝集试验将在 3537培养 1620 小时的活培养物与伤寒 Vi 及 O9、Hd 参考血清做玻片凝集试验，与 Vi 及 Hd 参考血清有强凝集反应（+以上） ，与 O9 参考血清不产生凝集或仅有较弱凝集反应。（2）定量凝集试验将在 3
4、537培养 1620 小时的活培养物，用 PBS 制成 6.0108/ml 的菌悬液，加入终浓度为 0.5%甲醛溶液，杀菌后的菌液，与伤寒 Vi 参考血清作定量凝集试验；另取经 10030 分钟加热杀菌的菌液，与伤寒 O 参考血清作定量凝集试验。充分摇匀后，放 37过夜，以肉眼观察结果，出现（+）凝集之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于血清原效价之半。4.4.1.2.4 种子批的保存冻干后的主种子库菌种和工作种子库菌种保存于 28。4.4.2 原液4.4.2.1 生产用种子工作种子批菌种启开后传一代于肉汤琼脂培养基，3537培养 1620 小时；传二代于肉汤琼脂培养基，3537培养
5、 1620 小时；传三代于改良半综合培养基，培养 35 小时，浓度达 3050 亿/ml 时用于大罐培养。4.4.2.2 生产用培养基采用改良半综合培养基，不含有与十六烷基三甲基溴化铵能形成沉淀的成份，见 3.1。4.4.2.3 培养采用培养罐液体通气搅拌培养。温度 3537、通气量50200L/min、pH6.87.4、培养 68 小时。在培养过程中及杀菌前取样进行菌液浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰染色镜检，如发现污染杂菌则予以废弃。4.4.2.4 收获及杀菌当菌液浓度达到 200320 亿/ml 时中止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查。按培养量的 1.2%加入甲醛溶液杀菌。4.4.2.
6、5 纯化4.4.2.5.1 去核酸4.4.2.5.1.1 去菌体采用连续流离心法将已杀菌的培养液离心后收集上清液。4.4.2.5.1.2 按终浓度 0.06%0.10%加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，存放 424 小时，形成沉淀。4.4.2.5.1.3 采用连续流离心法收取沉淀物，并用 0.5mol/L 的氯化钠溶液溶解沉淀物，搅拌 2 小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离。4.4.2.5.1.4 加入 95%乙醇至最终浓度为 25%，28静置 324 小时，离心收集澄清的上清液。4.4.2.5.2 沉淀多糖于上述上清液中加入 95%乙醇至最终浓度为 80%，充分振摇使多糖沉淀，离心收集
7、沉淀。沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗 2 次，干燥后即为多糖粗制品。 多糖粗制品应保存在20以下。4.4.2.5.3 多糖纯化将多糖粗制品溶解于 1/10 饱和乙酸钠溶液中，使其浓度达 520mg/ml；按1:2 容量用冷酚（100g 结晶酚溶于 40ml 的 1/10 饱和乙酸钠溶液）提取 3 次，离心收集上清液，并用注射用水透析；加入乙醇至最终浓度为 80%， 离心收集的沉淀物用无水乙醇洗 2 次，干燥后用灭菌注射用水溶解，即为精制多糖原液。4.4.2.6 原液检定多糖原液取样进行。4.4.2.6.1 鉴别试验采用免疫双扩散法（现行版中华人民共和国药典三部中附录 C） ， Vi 多糖与伤寒 V
8、i 血清 24 小时内应形成明显沉淀线，而与伤寒 O 血清不形成沉淀线。4.4.2.6.2 化学检定 4.4.2.6.2.1 固体总量依法测定（现行版中华人民共和国药典三部中附录 M） 。4.4.2.6.2.2 蛋白质含量不高于 9mg/g （现行版中华人民共和国药典三部中附录 B 二法） 。4.4.2.6.2.3 核酸含量不高于 15mg/g，核酸在波长 260nm 处的吸收系数（E ）为 200（现行版中1% 1cm华人民共和国药典三部中附录 A） 。4.4.2.6.2.4 O乙酰基含量不低于 2mmol/g （现行版中华人民共和国药典三部中附录 F） 。4.4.2.6.2.5 多糖分子大
9、小测定多糖分子 KD值在 0.25 以前的洗脱液多糖回收率应在 50%以上（现行版中华人民共和国药典三部中附录 H） 。4.4.2.6.3 无菌检查依法检查（现行版中华人民共和国药典三部中附录 A） ， 符合规定。4.4.2.6.4 细菌内毒素检查不高于 40EU/ug。4.4.2.6.5 苯酚残余量不高于 0.1g/L。4.4.2.6.6 甲醛残余量不高于 0.2g/L。4.4.2.6.7 丙酮残余量不高于 5.0g/L。4.4.2.6.8 乙醇残余量不高于 5.0g/L。4.4.2.7 保存及有效期于20以下保存，自多糖粗制品制造之日起有效期为 60 个月。4.4.3 半成品4.4.3.1
10、 半成品配制半成品由单批或多批多糖原液合并，用无菌无热原 PBS（pH 7.2）稀释。每 1次人用剂量含多糖不低于 30g，不含防腐剂。4.4.3.1.1 PBS 配方Na2HPO4 14.7g/万 mlKH2PO4 4.3g/万 mlNaCl 68g/万 ml4.4.3.1.2 PBS 配制正确称量 NaCl、Na 2HPO4和 KH2PO4，在大立瓶中用适量注射用水溶解，湿热灭菌。4.4.3.1.3 稀释配制用无菌无热原 PBS，将伤寒 Vi 多糖原液稀释到每 1 次人用剂量含多糖不低于30g，取样送检。4.4.3.2 半成品检定及贮存效期4.4.3.2.1 无菌检查依法检查（现行版中华人
11、民共和国药典三部附录 A） ， 符合规定。4.4.3.2.2 半成品配制至分装完成不超过 72 小时。4.4.4 成品4.4.4.1 分批应符合现行版 中 华 人 民 共 和 国 药 典 三 部 中 “生物制品分批规程”的有关规定。4.4.4.2 分装及冻干应符合现行版 中 华 人 民 共 和 国 药 典 三 部 中 “生物制品分批规程”的有关规定。4.4.4.3 规格每安瓿 5ml、1ml、0.5ml，每西林瓶 0.5ml。每 1 次人用剂量 0.5ml、含伤寒 Vi多糖不低于 30ug。4.4.4.4 包装应符合生物制品包装规程的有关规定。包装规格为 10 瓶/盒、1000 瓶/ 箱。4.
12、4.4.4.1 分装后制品，经质量保证部检定和综合审评，对符合质量标准者发出包装通知单后，进行包装。4.4.4.4.2 制品在包装前必须进行外观检查。凡制品颜色异常、有异物、封口不严、有黑头或裂纹等全部剔除。4.4.4.4.3 制品包装标签及标签的内容、格式符合中华人民共和国药品管理法及国务院药品监督管理部门的有关规定。4.4.4.4.4 包装前，按质量保证部发出的包装通知单所载有效期准备瓶签，瓶签上的字迹清楚。4.4.4.4.5 包装规格4.4.4.4.5.1 每安瓿 0.5ml，5 支/盒，1000 支/箱。4.4.4.4.5.2 每安瓿 1.0ml，5 支/盒，1000 支/箱。4.4.
13、4.4.5.3 每西林瓶 0.5ml，1 瓶/小盒，10 瓶/中盒，200 瓶/箱。4.4.4.4.5.4 每安瓿 5.0ml，5 支/盒，500 支/箱。4.4.4.4.6 包装制品在 25以下进行。4.4.4.4.7 每个最小包装盒内附有本制品的使用说明书。4.4.4.5 成品检定除装量差异、水分测定、多糖含量、多糖分子大小测定和异常毒性检查外，按制品标示量加入灭菌 PBS 复溶后进行其余各项检定。4.4.4.5.1 鉴别试验按 4.4.2.6.1 项进行 。4.4.4.5.2 外观为无色透明液体，无异物。4.4.4.5.3 化学检定 4.4.4.5.3.1 pH 值6.57.5 （现行版
14、中华人民共和国药典三部附录 V A） 。 4.4.4.5.3.2 多糖含量每人用剂量多糖含量应不低于 30g。称取 0.6g 琼脂糖，加入 0.05mol/L 巴比妥缓冲液（pH8.6）40ml 中，加热溶胀完全，待冷却至约 56时，加入伤寒 Vi血清 1ml，混匀后迅速倾倒于 10cm9cm 的洁净水平玻板上，待凝胶凝固后用直径 3mm 的打孔器在距底边 1.5cm 处打孔。各孔中分别加入各稀释好的伤寒 Vi抗原标准品溶液 （浓度分别为：100g/ml，50 g/ml，25g/ml，12.5 g/ml，6.25g/ml）和本品 5l（本品做双孔） 。靠近边缘一孔中可加入10l 溴酚蓝指示液。
15、加样后将玻板置于电泳槽上，滤纸搭桥，加样端与电泳仪负极相连。采用 0.05mol/L 巴比妥缓冲液 （pH8.6）为电极缓冲液，8V/cm恒压电泳至指示剂迁移到前沿。取下玻板浸泡于 0.9%无菌氯化钠溶液 12 小时后，覆盖洁净滤纸移至培养箱中过夜烤干。用考马斯亮兰染色液染色至火箭峰出现，用甲醇乙酸脱色液脱色至背景清晰。准确测量火箭峰高，以标准品浓度的对数和相应的峰高作直线回归，得直线回归方程，将供试品的峰高均值代入直线回归方程，求出供试品浓度。4.4.4.5.3.3 无菌检查依法检查（现行版中华人民共和国药典三部附录 A） ， 符合规定。4.4.4.5.3.4 异常毒性检查依法检查（现行版中华人民共和国药典三部附录 F） ，符合规定。4.4.4.5.3.5热原检查依法检查（现行版中华人民共和国药典三部附录 D） ，注射剂量家兔体重每 1kg 注射 0.025ug 多糖。4.4.5 保存、运输及有效期于 28避光保存和运输，自生产之日起有效期为 24 个月。4.5 质量监控：4.5.1 菌种4.5.1.1 菌种检定按本规程 4.4.1.2.3 的要求对每批菌种进行全面检定，检定合
