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1、改良 Masson 三色染色法在胶原纤维中的应用中华首席医学网 2006 年 05 月 24 日 11:05:41 Wednesday 648作者：王珏, 朱礼国， 唐幕湘, 张健郧阳医学院学报 2006 年 2 月 25 卷 1 期 实验技术 加入收藏夹 【关键词】 胶原纤维关键词 改良；Masson 三色染色法；胶原纤维目前，Masson 三色染色法仍是胶原纤维染色的主要方法之一。它在临床外检和科研教学等方面有着重要的意义。在实际工作中，我们认为传统的 Masson 三色染色法1操作程序多，染色效果欠佳，且不太稳定，对其做了改进，现将做法介绍如下。1 方法1.1 染液的配制Harris 苏
2、木素、1%盐酸酒精、丽春红酸性品红、1%磷钼酸、2%苯胺蓝.1.2 染色方法石蜡切片 34 m脱蜡至水 ,Harris 苏木素染 3 min 流水冲洗 ,1%的盐酸酒精分化 35 s 流水冲洗,温水返蓝 1 min 流水冲洗, 丽春红酸性品红加温染 3 min，蒸馏水冲洗,1%磷钼酸分化 1 min，不洗，擦净载玻片上的磷钼酸残液，2%苯胺蓝复染 1 min，95%的酒精冲洗，95%酒精及无水酒精脱水，冷风吹干，中性树胶封片。2 结果胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞质呈红色，细胞核呈蓝褐色。3 讨论通过长期实践探索，我们摸索出一种程序更简洁、组织着色效果更好，且性能稳定的改良 Masson三色染色法。
3、其原理是利用苏木素，酸性品红和苯胺蓝对结缔组织和神经嗜银颗粒、胶原纤维等组织染色，使时间缩短，步骤简便。改进后的方法，将传统的 Masson 三色染色法作了如下调整和改动：Bowin 氏液由 10%中性固定液2 代替，省略了 0.5%碘酒精作用 10 min，5% 硫代硫酸钠作用 5 min 和 1%冰醋酸处理 1min 及地衣红染 3060 min 等过程，然后将原丽春红酸性品红，1% 磷钼酸，2%苯胺蓝的染色时间分别由 15 min，5 min,5 min,缩短为加热 3min,1 min,1 min.通过对以上各步的调整和改进，使染色时间由原来的近 3 h，缩短为 30 min 左右，且
4、颜色对比度好，层次清楚，胞核胞浆着色均匀。值得注意的是：在经过 1%磷钼酸分化后的几步禁止用水冲洗，直接用 95%酒精洗，然后脱水，透明封片，这样可防止切片脱色，染出的组织切片效果更好。参 考 文 献1 凌启波. 实用病理特殊染色和组织化学 M.广东高等教育出版社.1989,7. 2 龚志锦, 詹洲.病理组织制片和染色技术M. 上海:上海科学技术出版,1994,10.（郧阳医学院形态学实验室;郧阳医学院附属太和医院病理科,湖北 十堰 442000）网状纤维网状纤维是一种纤细的纤维。它沿着网状细胞和突起分支，并互相交织成网，因而被称为网状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显著。故又称为嗜银纤维
5、。它主要由 III 型胶原蛋白构成，也具有 642nm 周期性横纹1。它主要分布于骨髓、脾、淋巴结、肝和肺等脏器。癌组织中间未见有网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维围绕，俗称癌巢。一、网状纤维的形成它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内浆网中，合成可溶性胶原。在醛糖、类脂的作用下，形成可溶性胶原，随后它被分泌到细胞外，在基质中（或在细胞的表面）通过原胶原蛋白分子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维。二、网状纤维在组织化学上的反应网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容易区别的。网状纤维是分支纤细的纤维。Van Gieson
6、氏染色不显色或微红色。PAS 反应呈现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用 Van Gieson 氏染色为红色，PAS 反应呈微粉红色。银浸染为黄*色或棕黄*色。三、网状纤维的显示1染色染料技术：从网状纤维的显示，区别和效果等方面，这种技术被认为是不可靠的，其原因是它只能跟胶原纤维区别开来。2金属浸染技术：这种技术对于显示网状纤维被认为是十分可靠和广泛使用的方法，它不但能够区别网状纤维和胶原纤维，而且可显示纤细的网状纤维。嗜银反应（Argyrophil reaction）嗜银细胞与亲银细胞所不同的是需要一种附加的还原剂来还原，它们比亲银细胞数量多。必须注意：亲银反应中将找不到任何的嗜银细胞。亲银反
7、应（Argentaffin reation）亲银细胞有能力，直接地，不靠外加试剂，将银液中的银还原为一种不溶性的黑色金属银沉淀的细胞称为亲银细胞。 （Cells that have the ability to directly reduce silver solution producing an insoluble black metallic silver precipitate are termed-angentaffin cells） 。四、网状纤维的显示方法有 Gomoris 法、Godon and sweets 法、Wilders 法、Foots 法（一）Gomoris 法1、试
8、剂的配制：取 10%硝酸银 3 份，加入 10%的氢氧化钾 1 份，混合后产生大量的黑色沉淀物，倒去表面的液体，保留下沉淀物，加入 10-20 倍或更多的蒸馏水进行冲洗，连续冲洗 3 次。待沉淀物清晰则可。用浓氨水逐滴加到溶液中。使沉淀物逐步溶解。待见沉淀物剩少数几颗时，再取 10%的硝酸银液加入数滴，至溶液再现浑浊为止。再用氨水将其溶解，然后稀释 10-15 倍。即可使用。平时保存于 4冰箱中。2、操作步骤：(1)、切片脱蜡至水，蒸馏水洗，(2)、用 0.5%高锰酸钾氧化 5min，(3)、自来水洗，继用蒸馏水洗，(4)、用 2%草酸漂白切片 2min，(5)、自来水洗，蒸馏水洗，(6)、2
9、% 硫酸铁铵媒染 5min，(7)、水洗，蒸馏水洗，(8)、滴入氨性银溶液浸染 3-5min，(9)、蒸馏水洗数次，(10)、10% 甲醛液还原 5-10min，(11)、水洗 2min，(12)、用核固红染色 10-15min，(13)、水洗 10min，各级酒精脱水，(14)、常规透明，中性树胶封固。结果：网状纤维黑色，核红色，胶原纤维黄棕色。(二).Gordon 和 sweets 氏法试剂的配制：取 10%硝酸银水溶液 5ml,逐滴加入浓氨水，至形成沉淀物，再逐滴加氨水，将初次形成的沉淀物溶解。注意氨水不能加入过多。取 3%过氧化钠 5ml 加入，即可能产生沉淀，再逐滴加入氨水至沉淀再度
10、被溶解。加入数滴 10%硝酸银，加入蒸馏水制成 50ml 溶液，即可使用，贮藏于 4冰箱中。1、切片脱蜡至水。2、1%高锰酸钾氧化 5 分钟。3、水洗。4、2%草酸漂白 1-2 分钟。5、水洗。6、2%硫酸铁铵媒染切片 10 分钟。7、蒸馏水洗。8、氨银溶液浸染 2 分钟。9、蒸馏水冲洗数次。10、10%福尔马林还原 2 分钟。11、自来水洗。12、5%偏重亚硫酸钠处理 3 分钟。13、自来水洗。14、0.2%氯化金调色 3 分钟。15、自来水洗。16、如果有要求，可做对比染色，如用核固红染核。17、脱水，透明，封固。结果：网状纤维显示黑色，如有对比染色，细胞核显示红色，胶原纤维不着色。(三)
11、Wilder 氏法。1、切片脱蜡至水。2、1%高锰酸钾氧化 5 分钟。3、流水洗。4、2%草酸处理 1-2 分钟。5、流水洗。6、1%硝酸铀 10 秒钟。7、蒸馏水洗。8、氨银溶液浸染 1 分钟。9、95%酒精速洗。10、于显影液内显色 1 分钟。11、蒸馏水洗。12、0.2%氯化金调色 1 分钟。13、蒸馏水洗。14、5%亚硫酸钠处理 1-2 分钟。15、水洗。16、如有需要，可作对比染色。17、常规脱水，透明，封固。结果：网状纤维：黑色，其余着对比染色，胶原纤维不着色。(四).Foot 氏法1、切片脱蜡至水。2、1%高锰酸钾氧化 5 分钟。3、自来水洗。4、2%草酸处理 1-2 分钟。5、
12、自来水洗，蒸馏水洗。6、于碳酸氨银液中，在 56烤箱内浸染 40-60 分钟。至切片呈黄棕色。7、速洗蒸馏水。8、20%福尔马林还原 5 分钟。9、水洗。10、0.2%氯化金水溶液调色 1-2 分钟。11 自来水洗。12、 、5%硫酸钠固定切片 1-2 分钟。13、如果需要，可作对比染色。14、脱水，透明，封固。结果：网状纤维显示黑色，其它着染对比染色，胶原纤维不着色。五、银染注意事项：1、所使用的玻璃仪器，须用清洁液处理。2、配制氨银溶液时，氨水加入的量不能过多或不足，过多感应下降，会使液体过碱，滴染时，切片容易脱落，过少则感应上升，浸染效果不佳，不好掌握。3、配制氨银液时，有可能用玻璃蒸馏
13、水。4、使用的化学试剂应尽量用分析纯以上。5、切片氧化漂白应彻底，不能使残存的福尔马林留于片上，否则将导致过早还原而使浸染不均匀。6、如果有某种原因而导致切片脱落时，应使用涂胶的载片，以增加附贴性，7、如有可能，氨银溶液以新配为佳，但也可保存于 4冰箱中达一个月左右，这种液体易挥发，用后即须盖紧，当沉淀物出现时，该溶液应抛弃，8、20%福尔马林还原 5 分钟。9、应秀氯化金调色时，可将胶原纤维着染的黄棕色去除掉。10、上述四种方法，根据各单位个人的需要或爱好选择，没有什么区别。六、临床应用1、可用于区别癌和肉瘤的诊断，例如：网织细胞肉瘤和转移于淋巴结内的未分化癌，这两者在 HE 的染色切片都较
14、难区别，前者可产生网状纤维，后者不产生网状纤维。鼻咽部活柱，应将网染作为常规，给予使用，可增加诊断的准确性。2、可用于区别血管内皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤） ，它的瘤细胞在网状纤维膜内，而血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤的瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤的瘤细胞可见较多的网状纤维。3、可用于神经系统方面肿瘤的区别，如：交感神经母细胞，脑的髓母细胞瘤，这些肿瘤的形态有时象肉瘤，但银染时，神经系统的网染为阴性，不过脑的原发性肉瘤有较多的网状纤维。4、可用于观察癌组织的发生发展过程。如：原位癌，可见有完整的基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏的基底膜。5、可用于区别淋巴系
15、统方面的肿瘤，如：淋巴肉瘤和网织细胞肉瘤，前者瘤细胞间的网状纤维比正常稍减少，后者则比正常时增多。6、可用于急性骨髓纤维化的鉴别诊断，该病的网状纤维增多，纤维可以是致密和融合性的。胶原纤维染色通常呈阴性，尽管偶尔有的病例可能显示胶原纤维化。弹性纤维弹性纤维主要由弹性蛋白（一种黄*色硬蛋白，它是黄*色弹性纤维组织的主要成分，干燥时易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性）构成。它广泛分布于全身的各个部位，尤以循环系统，呼吸系统和皮肤系统为甚。新鲜时它呈黄*色，固又称为黄*色纤维。弹性纤维较细，直径0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交织成网。它富有弹性，容易拉长，但不能拉到超过它的极限，外力除去后又恢复
16、原状。弹性纤维与胶原纤维交织在一起，在 HE 染色的标本上，含量少时不易与胶原纤维区别，含量多时呈折光性强的淡粉红色。由弹性蛋白构成弹性纤维的鞘，并非完全的密封，在其周围有许多微细孔，这些微细孔可作为营养物及排除废物的场所。弹性纤维主要来源于带有平滑肌特征的间胚叶细胞，少量可由脉管的内皮细胞产生，先形成前弹性蛋白（pro-elastin ），这时在电镜下可见到直径为 200nm 的电子密度微纤维，在成熟的弹性纤维蛋白，电密度减少或丧失，较为均匀一致。弹性纤维与胶原纤维，网状纤维不同，它极难容于有机或无机的溶液里。一、弹性纤维的变形和病理变化随着年龄的增长，特别是到了老年的时候，弹性纤维可发生生理性的变化，这时可观察到弹性纤维的纵行分裂，断成碎片，最后成为颗粒，这些变化同时也伴有化学变化，氨基酸和钙的含量有所增加，这些变化在皮肤是最明显的。当有病变的时候，我们便可在切片观察到有的
