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1、拟南芥 T-DNA 插入突变体的鉴定实验目的1. 通过实验学习并掌握用 CTAB 来提取 DNA 的方法。2. 了解 CTAB 的成分及作用。3. 学习 PCR 的原理并掌握其方法。4. 学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。实验原理植物组织中绝大部分是核 DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称 CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将 CTAB
2、与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。DNA 是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物 DNA 的结构和功能，还是开展外源 DNA 的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化 DNA。T-DNA，转移 DNA（transferred DNA ） ，是根瘤农杆菌 Ti 质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的 T-DNA 区
3、，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA 插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA 大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析 。PCR 基本原理：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增 DNA，具有类似细胞内 DNA 的复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链 DNA 变性为单链 DNA、单链 DNA 能与引物复性（退火）成为引物-DNA 单链复合物、以及在 dNTPs 存在下 DNA 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成
4、为双链 DNA（引物的延伸） ；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个 PCR 循环；一般通过 20-30 个循环之后，就可获得大量的要扩增的 DNA 片段。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA 分子在高于其等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形 DNA 分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！） ，其分子可插入DN
5、A 的碱基之间，形成一种光络合物，在 254365nm 波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的 DNA 进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：增大样品密度，确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；以 0.5TBE 做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长700bp 的双链 DNA 相同，二甲苯氰（蓝）则与 2Kbp 的 DNA 相同。T-DNA 插入突变体 PCR 鉴定图解：T-DNA 插入突变体的引物位点PCR 电泳图验仪器材料和试剂实验材料：拟南芥叶片实验仪器：电热恒温水浴锅；离心机；液氮罐；研钵；离心管；移液管；
6、稳压稳流电泳仪；可调微量移液器；水平电泳槽；暗箱紫外透射仪。实验试剂：CTAB 分离缓冲液；氯仿/异戊醇；无水乙醇；70乙醇溶液；NaAc；TE 缓冲液；电泳缓冲液；加样缓冲液；溴化乙锭（EB）溶液；琼脂糖凝胶（浓度为 1.2%）。实验步骤植物 DNA 的提取1.取 CTAB 分离缓冲液加入离心试管中，于 65水浴预热；2.取 2-3 片新鲜叶片于离心管，加入液氮研磨细粉末；3.加入 600 ul 预热的 CTAB 分离液，轻轻转动，混匀，65水浴保温 45min；4.12000rpm 离心 10min；5.将上清液转移到新离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻摇动，混匀；6.12000rpm
7、 离心 5-10min，将上清液转移到新离心管；7.向上清中加入 1/10 体积 3M NaAc，再加入两倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，冰上放置 10min；8.12000rpm 离心 10min，弃上清，加入 500 ul70乙醇溶液洗涤 2min；9.12000rpm 离心 5min，弃上清吸干残留并干燥；10.加 40 ulTE 缓冲液溶解 DNA。PCR 反应按照下表装填反应体系：反应物 用量（ul）H2O 12.310Buffer 2.0dNTPs 0.5MgCl2 2.0LP/BP 0.5RP 0.5Taq 聚合酶 0.2DNA 2.0总计 20.0调节 PCR 仪，使其按照 9
8、4 5min，94 30s，53 30s，72 1min30s，重复 33 次，72 10min 的方式进行。琼脂糖凝胶电泳1凝胶板的制备：取琼脂糖 0.48g，加 0.5TBE 缓冲溶液 40ml，微波熔化，制成 1.2%的琼脂糖胶液。将 60凝胶不间断倒入胶床，高 34mm，避免气泡，室温下凝固。完全凝固后，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面 12mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。2加样：在两份 PCR 产物中各加 4 ul6Loading Buffer，在样品 DNA 中加缓冲液 2 ul，混匀，用微量进样器加样，加样量 10l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透
9、凝胶底部） 。3电泳：120V 电压电泳，至少 40min。4染色、观察、显微照相与记录：关闭电源，取出胶床，浸入 EB 溶液中，10min 后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的 DNA，并进行显微照相。实验结果及分析1.实验结果：注释：第一孔道为 DL2000 marker；第五至七孔道为本人实验结果（25 号样品） ，依次是 PCR 前的样品 DNA、引物为 LPRP 的 PCR 产物和引物为 BPRP 的PCR 产物。2.实验分析：若拟南芥为野生型，即无 T-DNA 插入，不存在 BP 位点，因此，电泳时，只有 LPRP 的 PCR 产物存在，而 BPRP 的 PCR 产物不存在；若拟南芥
10、为纯合突变体，即两条链均有 T-DNA 插入，都存在 BP 位点，因此电泳时，由于大片段的插入， LPRP 的 PCR 产物不存在，只有 BPRP的 PCR 产物存在；若拟南芥为杂合突变体，即有一条条链有 T-DNA 插入，其中存在 BP 位点，因此电泳时，突变的那条链，由于大片段的插入，LPRP 的 PCR 产物不存在，只有 BPRP 的 PCR 产物存在，另外一条链则只存在 LPRP 的 PCR 产物。观察图片，两个 PCR 产物电泳所得的结果均是一条条带。LPRP 的 PCR产物大小在 1000bp 左右，BPRP 的 PCR 产物大小在 800bp 左右，与预期结果相符，因此，25 号拟南芥为杂合突变体。
