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1、PhyML 利用氨基酸序列建树步骤（核酸建树也可以作为参考）吴碧波前言：本文阅读对象适合建树新手，生物信息学高手请勿嘲笑，其中有什么错误还恳请指点。为什么要建树及其你要解决什么问题这里不做讨论，只是一个纯粹的建树过程，前期的序列收集过程自己费心，根据自己的需要来做。这里主要是最大似然法来建树，NJ法像 mega 这些软件中都有集成，最新的 mega7 也集成 ML 法，不过模型及各种参数不一定适合你，所以学习多种多种方法也是有用的，PhyML 速度较慢，如果数列数量较多、步长检验次数多，等待时间会很长，有可能达到几十小时，也与电脑配置有关，一般时间都是以小时计数，所以要有心理准备，如果数据量大
2、，推荐用 RaxML 或其他方法建树，它处理速度要比 PhyML 快，不过 RaxML 是命令操作，对不熟悉命令及参数设置的人有一定难度，我也只在 linux 下操作过，没有在 win 环境中使用过。本文是用氨基酸建树过程，如果你是用核酸序列建树，也可以参考这个过程，核酸替代模型请用 jmodeltest 或其他同功软件计算。由于 PhyML 计算过程比较长，做一遍很耗时，推荐你用其他软件用 NJ 法先行试验建树，看看你选择的序列是否有效及符合你的预期结果，调整好序列后再用 PhyML 跑一遍看结果是否符合自己的要求。PhyML 有线上版本，http:/www.atgc-montpellier
3、.fr/phyml/，只需要提交序列比对结果，设置模型参数，留下邮箱等待就会给你返回结果，不过时间不可控，根据试剂情况选择线上还是本地自己建树。水平有限，如有错误遗漏恳请各位指点，文末有微信联系方式，欢迎骚扰-。 环境准备：电脑-Windows 或者 Linux 都可以（没试过 mac，你自己看办吧） 、java环境、ProtTest、PhyMl 及序列比对的软件，线上或本地都可以的。1. 序列准备：在自己熟悉的数据库中（我自己比较熟悉 Ncbi）上做 blast，选取跟要建树蛋白同源的各物种序列，下载到本地，整合到一个 fasta 文件中，注意修改物种名称，字数最好不要太长，序列比对后.ph
4、y 格式文件对文件名长度有限制（这个可能跟软件有关系，只要自己知道是什么物种，不至于混淆就行） ，注意规范性，fasta 文件中最好除了头标，字母及下划线不要有其他不相关的字符，因为如果后面你要用软件分析.phy 文件的时候这些软件对.phy 的格式要求比较变态，有其他多于字符它都会报错的（你如果在dos 下用命令合并文件请注意文件的最后一行的字符，请删除） 。做序列分析，常用的分析软件有 clustalW 系列，mega 也集成了集中蛋白比对工具，线上线下各种软件自由选择，区别不大，保存的格式可以选择多一点，主要是看你后续操作。如 clustalx 比对可以保存的结果格式如图 1 所示。选中
5、你希望的格式保存即可。图 1.clustalx2 输出文件设置注：有的软件运行打开你需要比对的 FASTA 格式文件时候是不能有中文路径的，比如 clustalx 这货就打不开有保存在中文路径下的文件。2. 用 ProtTest 选择建树中所需要的模型Windows 下点击 runXProtTestHPC.bat 运行 prottest 软件（注意这货执行文件不能放到有中文字符路径中，Linux 平台下你知道如何运行的- ） ，打开你你要建树的 phy 格式文件，如果文件没有问题，打开界面如图 2，如果打开文件中有其他非规范性字符就会报错。图 2.ProtTest 打开文件界面点 analys
6、is-compute likelihood scores （图 3）出现图 4 设置界面，替代模型默认全部选择，可以不用管，直接默认及好，rate variation 全选默认不变，categories 默认是 4，这个范围可以设置 4-8，数值应该是越大越好，但会增加计算时间，根据你的情况选择，如果不明白就保持默认 4。Amino-acid frequencies 勾选 Empirical，如果不选这个，计算模型变为 60个，会减少计算时间，推荐勾选，最后一个 Starting topolpgy 选型改为 Maximum Likelihood tree，最后点击 Compute 计算，长时间
7、等待.（看你用的机器配置情况咯，没办法）图 3. ProTest analysis 选项图 4.analysis 设置界面经过长时间等待后计算完成，返回结果，如图 5。第一行 deltaAIC 值为 0 的即使所需要的建树模型。在结果中翻出如下数据，记下标红这两个参数，在后面用 PhyML 建树中会用到这两个模型参数。到这里，模型选择算是完成了。Model. : LG+I+G+FNumber of parameters. : 50 (21 + 29 branch length estimates)gamma shape (6 rate categories). = 0.524proportio
8、n of invariable sites. = 0.13aminoacid frequencies. = observed (see above)-lnL. = 8665.99(seconds)图 5.ProTest 结算结果3. PhyML 建进化树：模型选择好后就是建树了，请把前面做好比对的 filename.phy 文件复制到 PhyML 执行文件同一个文件夹中，点击 phyml.bat 打开 PhyML 软件（Linux 下你知道如何运行的-） ，打开界面见图 6，输入 phy 格式文件名字，eg：filename.phy，注意要带格式后缀。图 6. PhyML 界面输入文件名后出现
9、图 7 的界面，设置各种参数，选 D，改为 AA（氨基酸） type，输入序列格式根据你的文件类型选择，有两种，区别见图 8。图 7. PhyML 参数设置界面图 8. Interleaved sequential 类型区别安“+”号进入下一项模型设置，界面见图 9，按 M 可以选择不同模型，根据前面prottest 做的结果选择你需要的模型，按“V”设置 proportion of invariable sites，按“A”设置 gamma 值。再次提醒，这两个值就是 prottest 计算结果中的我标红的这个。Model. : LG+I+G+FNumber of parameters. :
10、 50 (21 + 29 branch length estimates)gamma shape (6 rate categories). = 0.524proportion of invariable sites. = 0.13aminoacid frequencies. = observed (see above)-lnL. = 8665.99(seconds)注意“C”选项，根据你前面 prottest 中设置的 categories 值来确定，两者最好是一致的。图 9. 模型设置最后设置好后应该是图 10 这个样子。图 10，模型设置完成模型设置好后继续按“+” ，回车进入下一项设置，
11、这里主要设置分析速度相关项，设置好后如图 11。 “S”项选 slow 主要是为了分析的正确性。慢一点会更好，当然也有其他选项，根据自己情况选择。 （原谅我对是否增加随机树这个不是很清楚，我试了一遍好像没什么影响，对这个也不是特别理解） 。图 11. 设置继续 “+”“enter”，进入下一项 bootstrap 检验设置， “B”选项设置验证次数，数值为 100 的倍数，数值越大，建树过程越长，如图 12图 12. Bootstrap 设置设置好这些后检查没有问题就按“Y ”，回车开始计算过程，经过几个或者十几个或者几天的计算，duang 的一声结果就在你的电脑上出现了，意外不意外，惊喜不惊喜树以文本文档形式保存，如图 13。其中的 filename.phy_tree.txt 就是树文件了，可以用 treeview 打开，编辑美化就 OK 了。图 13.建树结果文件用 PhyML 建树过程基本上就是这样，如有什么遗漏错误欢迎指正，有其他问题也欢迎一起探讨，本人微信：464021669，转载请注明原作者。201711 月.
