免疫学实验指导080410

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1、1免疫学实验指导生命科学与工程学院生物工程、生物技术、 动物医学专业用冯玉萍分组：4 人/组 ，实验用动物、器材以每组需要量设计班级 2006 生物工程 、生物技 术 学生人数：65 人/58 人 。 分 16 组/15 组时间 2008 年 3 月2008 年 7 月 两周一次 4 学时 。目 录实验一、免疫学实验动物的一般操作实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验四、淋巴细胞分离与 E 玫瑰花环形成试验实验五、IgG 的分离和纯化实验六、玻片凝集试验(ABO 血型鉴定)实验七、环状沉淀试验实验八、琼脂扩散试验（单向）实验九、巨噬细胞

2、吞噬功能试验实验十、白细胞吞噬试验2实验一、免疫学实验动物的一般操作实验原理 实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果，通过实验动物进行验证，因此必 须掌握实验动物的一般操作技 术。目的要求1实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）2了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。自学3学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。4练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。5练习小白鼠的取血方法。6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。实验动 物 小白鼠，2 只/组，共需 18 20 只。试剂 3%来 苏儿或 3%石炭

3、酸 100150 ml/组； 无菌生理盐水 100150ml/组；磷酸盐缓冲液 2050ml/组（带滴管、染色用）。 3 5% 苦味酸 2050ml/组（带滴管,编号用）； 5%品 红 20ml50ml/组 （带滴管，编号用）； 瑞特氏（wright s）染色液 50ml/组（带滴管，染色用）；*抗凝剂一支器材 1ml 注射器及针头 2 支/组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量； 手术剪刀 2 把/组；镊子 2 把/组；载玻片、盖玻片各 6 片/组； 毛细吸管 2 支、50100ml 烧杯 1 个/组3 显微镜 6 台/组6 鼠笼 1 个 /组操作步骤1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、

4、皮内注射、腹腔注射的方法。（见免疫学实验P9-13 。2、练习小白鼠尾静脉取血法。（P15）实验报告要求：1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、 结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析 总结实验 是否成功，是否达到实验目的？为什么？5、对实验动物编号有何实际意义，你 对书中关于小白鼠的编号方法有何想法？有无更简便、实用的方法？6、若给动物注射传染性材料应注意些什么？实验二、免疫器官与免疫细胞观察实验原理 免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。在胸腺、脾 脏中有大量淋巴细胞存在，在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫 细胞存在，

5、发挥着免疫监视作用。4目的要求 1、练习血涂片的制作2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法，观察小白鼠的解剖结构；3、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法；观察小鼠脾脏触片、血液涂片中的免疫细胞，并画图。方法与步骤1、练习血涂片的制作（3 张/组）1）准备一张洁净玻片，取血 1 滴于玻片右侧,另取一光边玻片的一端,放在血滴前方,并逐渐后移接触血滴,血液立即沿推片散开,然后将推片与载片保持 30 一45 度角,平稳地向前推动,至玻片另一端,载玻片上便留下一层血膜。良好的血膜象舌头,头、体、尾鲜明,厚薄适宜、分布均匀 ,边缘整 齐,两侧留有空隙。2）染色：A、瑞特氏 (WrightFs)染色法：.血涂片制成

6、后可在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。选择良好的血片，用特种玻璃铅笔画出两边界限(注意保留尾部，因体积大的细胞往往在此出现) ，以防染液外溢。在血膜上滴加几滴瑞氏染色液,左右晃动，使染液完全覆盖血膜，注意染5液不宜过多而溢出界限，亦不能过少而干燥。12min 后，滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水，23min 后，可见表面有金属光泽，即可用清水轻轻 冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。在正常的情况下，血膜外观染成粉红色。3）镜检：先在低倍镜下检查血片，染色是否合格，血细胞分布是否均匀等,然后换高倍镜或油镜观察，并 绘图，指出淋巴 细胞与白 细胞、 红细胞。如自己图片不成功，则对教学片

7、进行观 察和绘图。结果：血液涂片瑞特氏染色法染色的结果：中性粒细胞：是白细胞中数量最多的细胞，胞体大于红细胞，细胞核蓝紫色，呈分叶形，可分 25 叶。叶间有细丝相连；细胞浆为 粉红色，其中充 满褐灰色的小颗粒。嗜酸性粒细胞：数量少，占白细胞总数的 0.53%。胞体较中性粒细胞大，胞核蓝色， 颗粒粉红色。嗜碱性粒细胞：细胞核蓝紫色，颗粒蓝色。红细胞数量最大，边缘厚（浓染），中央薄（淡）。淋巴细胞细胞质天蓝色，细胞核几乎占据整个细胞。B、姬姆萨染色法： 用甲醇固定标本 10 分钟，或醋酸：甲醇=1：3 的混合液固定 30 分钟。 用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材料面，注意不要有气泡。 染色 101

8、5 分钟后，用自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明 5 分钟。 用光学树脂封片后观察。6结果：血液涂片姬姆萨染色法染色的结果：有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞浆染成粉红色。无核细 胞染成：C、血液 标本片 观察结果：2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。或用乙 醚麻醉致死。 3、仔细解剖小鼠，观察小鼠的内脏器官，找出脾 脏 、胸腺，分别做触片（3 张/组）并用瑞特氏(WrightFs)染色法或姬姆萨染色法染色、观察。4、观察标本片，绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。结果1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果：2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果：3、标本片观察结果：实验报告要求：1、时间、地点、操作

9、人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、 结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析 总结实验 是否成功，是否达到实验目的？为什么？5、绘图描述：人、鼠血液涂片中的淋巴 细胞、粒细胞、红细胞7实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验原理 抗原免疫动物后，其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。血清是体液的重要组成部分，存在大量抗体。学会了制备血清的方法，就学会了制备抗血清的方法。红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原，也是可溶性抗原的载体及补体结合反应中指示系统的组成成员。在许多免疫学检测中都要用到红细胞，因此，血清与红细胞的制备技术，是

10、免疫学实验的基本技术。目的要求 1学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法；2学习动物血清、红细胞的制备方法；3掌握离心机的使用方法。4解剖鸡、兔，观察免疫器官。实验动物 鸡、兔各 1 只/2 组，共需 鸡 5 只、兔 5 只。试剂 3%来 苏儿或 3%石炭酸 50 100 ml/组； 无菌生理盐水 150ml/组；分两瓶（100ml/瓶、 50ml/瓶） 500 单位/ml 的肝素溶液 25ml/班。器材 10ml 注射器及针头 2 支/组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；50-100ml 烧杯 1 个/组； 手术刀、剪、镊子各 1 把/组；8 50100ml、 带玻璃珠的无

11、菌三角烧瓶 1 个/组（可用 20ml 链霉素瓶代替）； 无菌试管及试管塞 6 套/组；离心管 2 支/组；（6）离心机 1 台/6 组，共 3 台； 试管架 1 个/组、恒温培养箱一个 /班、冰箱一个/班。操作步 骤1、兔耳静脉采血（P19）2、兔耳中央动脉采血（P19）3、兔心脏采血：（P18）4、鸡翼根静脉取血（P19）5、鸡心脏取血（P18）。6、离心法制备血清：取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中，平衡离心管，离心 1020 分钟/2000 3000rpm。用毛 细滴管吸出血清，将获取的血清分装于已灭菌的小瓶内，加盖并用封口胶将瓶口封住，贴上标签注明血清的名称及制备

12、日期，置低温冰箱中保存备用。7、沉淀法制备血清：取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管（或平皿）内，加盖置 37温室内 2 小时，凝固后用无菌滴管沿 试管（或平皿）边缘将血块与皿壁脱离，然后放入 48冰箱中过夜，使血清充分析出。吸取血清分装于已灭菌的小瓶内备用。8、动物血红细胞制备：(1) 无菌操作取静脉血，将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振 摇数分钟以脱纤维抗凝。(2)取适量的脱 纤维血，用 25 倍无菌生理盐水洗 2 次，每次 2000rpm，离心 10 分钟，弃上清后用无菌生理盐水配成 20%的红细胞悬液，置 4冰箱保存备用。作业：实验报告1、 简述无菌采血应注意哪些事项？

13、2、 离心机操作中应注意哪些问题？3、血清制备中应注意哪些问题？ 94、红细胞制备中应注意哪些问题？备注：实验前请仔细阅读免疫学实验！实验四 血球凝集反应和交叉配血试验实验原理 红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体，在适量电解质存在的条件下，经一定时间后，凝集成肉眼可 见的凝集物。抗原抗体的 这种反应，称 为凝集反应。在人的 ABO 血型中，A 型血的红细胞上有 A 抗原，血清中有抗 B 抗原的抗体；在 B 型血的 红细胞上有 B 抗原，血清中有抗 A 抗原的抗体；故 A 型血的红细胞与 B 型血的血清混合 时，在有 电解质存在的条件下就可能发生凝集；同样，B型血的红细胞与 A 型血的血清混合

14、，在有电解质存在的条件下也可能 发生凝集；AB 型血的 红细胞上，既有 A 抗原，也有 B 抗原，而其血清中既无抗 A 抗原的抗体，也无抗 B 抗原的抗体；而 O 型血的红细胞上既无 A 抗原，也无 B 抗原，而其血清中既有抗 A 抗原的抗体，也有抗 B 抗原的抗体，故 AB 型血的血清与 A 型、B 型、O 型血的红细胞混合，均不会 发生凝集，也就是 说 ，AB 型血的人能接受 A型、B 型、 O 型血液的输血；而 O 型血的血清与 A 型、B 型、AB 型血的红细胞混合，均可能发生凝集；既 O 型血的人不能接受 A 型、B 型、 AB 型血液的输血，但他却是万能输血者，其红细 胞可以输给任

15、何血型的人。兔、鸡是否也有相应的血型？尚不清楚。本实验可自行设计，在有生理 盐水存在的条件下，利用不同组 的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的 红细胞和血清的混合，观察凝集现象和溶血现象，并分析、总结实验结果。 目的要求101、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进 行交叉，自行设计，观察鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合，产生的凝集现象和溶血现象。2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。试剂 0.85%生理盐水，100ml/组；5ml 注射器 2 支 /组。器材 载玻片每人 1 张、小试管 4 支/组，毛 细滴管 2 支/ 每组。操作步骤1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成 0.5%的混悬液。2、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象：取 1#兔（鸡）血清 1 滴于载玻片上，加入 2#、3#兔（鸡）红细胞，用火柴棒混匀，过 1015 分钟 ，观察，血球凝集 现象。3、兔与鸡（鸡与兔）配血，观察血球凝集现象取 1#、2#兔（鸡）血清 1 滴于载玻片上，加入 1#、2#鸡（兔）红细胞，用火柴棒混匀，过 1015 分钟，观察，血球凝集现象。4、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象：取 1#、2#兔（鸡）血清 0.51ml，加入 0.5%的 1#、2#鸡（兔）红细胞，混匀，静止过 1520 分钟 ，观察上清液是否溶血（变红），血球是否凝集？（沉淀物