《小鼠小脑皮层颗粒细胞的原代培养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠小脑皮层颗粒细胞的原代培养（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 小鼠小脑皮层颗粒细胞的原代培养I 准备工作：1) 打开制冰机。2) 打开水浴摇床，温度设定为 37 度。3) 将一瓶 PBS 溶液放入冰箱中预冷。4) 将以下物品放入无菌台中，打开紫外灯照至少半小时：蓝枪头，黄枪头，移液管筒，巴斯德管筒，无菌水，20PORN，Versene ，两个 15ml 离心管，大培养皿，解剖工具（一把大解剖剪，两把平头镊子，两把尖头镊子） ，显微镜，小培养皿。II 实验方法1) 把 20的多聚鸟氨酸（Poly-Ornithine，PORN）用无菌水稀释到 1的浓度，35mm 细胞培养盘每盘加入 1ml，放入 37CO 2 培养箱至少预孵育 1 小时。2) 用大解剖剪将
2、小鼠的头部剪下，放入装有预冷的 PBS 的大培养皿中，培养皿放在装满冰的冰盒中。3) 用一平头镊子夹住其头部靠近鼻子处，用另一尖头镊子从眼部将其皮肤撕开一个口，然后将皮肤向头的后部拉，皮肤全部撕下后，露出头骨包裹着的脑。用尖头镊子从左右半球的中线将头骨划开（一横） ，再沿着左右半球的前沿划开头骨（一竖） 。注意不要划得太深，避免损伤下面的脑。用尖头镊子轻轻将其头骨从中间划开的地方分别向左右半球两侧撕剥，直至头骨全部去除。用镊子在大脑下轻轻滑动，将其颈骨轻轻撕下，将整个脑部轻轻剥离下来，转移至另一装有预冷 PBS 且放在冰盒中的培养皿中。依此步骤处理所有小鼠头部，将脑分离出来。4) 将分离出来的
3、一个脑部转移至另一个装有 PBS 的新的培养皿中。把此培养皿放在解剖显微镜下，通过显微镜观察并操作。用一个平头镊子插住脑部左右半球，固定脑部，用尖头镊子去除小脑表面的脑膜和血管等组织，从上丘和下丘处分离小脑，将小脑置于装有预冷的 PBS 的 15ml 离心管中，离心管放在冰盒中。依此步骤处理所有小鼠脑部，将小脑分离出来。5) 将装小脑的离心管用酒精棉擦拭，拿入无菌台。用 PBS 冲洗小脑组织三次，每次 3ml。6) 向离心管中加 23ml Versene，放入 37水浴摇床孵育 8min。7) 把步骤 1)的小培养皿从培养箱中取出，放入无菌台。用巴斯德管吸去PORN，用 1ml PBS 洗两遍
4、。8) 将步骤 6)中 Versene 孵育完毕的离心管用酒精擦拭，拿入无菌台，用 PBS 冲洗 3 次小脑组织。注意不要太快速，避免吹散细胞。9) 加入适量含有血清的 CVL 培养基，用蓝枪头轻轻吹打细胞。不要太快速，避免吸入枪中，也避免吹打出大量泡泡。10) 将离心管静置 2min，使未完全酶解分散的组织团块下沉。11) 用黄枪头小心地吸取含有细胞的上层悬液，转移到另一个 15ml 的离心管中。12) 重复步骤 10)-12)两遍，直到把所有的单细胞悬液都收集到离心管中。13) 将离心管放入离心机，注意用另一管加水配平。1000rpm 室温下离心5min。14) 离心结束后，酒精擦拭离心管
5、，拿入无菌台，用枪头吸去上清，再用含有血清的 CVL 培养基重悬细胞。15) 每个 35mm 细胞培养皿中加 2mlCVL 培养基，再加 0.1ml 的细胞重悬液，十字交叉法摇匀。培养皿上注明日期。放入 CO2 培养箱中培养 23 天。一个小鼠的小脑大约有 750000 个神经细胞。一般是 6 只小鼠可以分 8 盘35mm 培养皿（0.8ml 细胞重悬液） 。依此计算实验所需老鼠和最后重悬细胞时所需的培养基用量。III 实验所用溶液和培养基1) DMEM-F12（4）将两包 DMEM 粉剂和两包 F-12 培养基粉剂溶解于三蒸水中，定容至 2L，过滤除菌，4保存。2) 7.5% NaHCO3将
6、 7.5g NaHCO3 溶解于三蒸水中，完全溶解后定容至 100ml，过滤除菌，4保存。3) 30 Glucose将 30g Glucose 溶解于三蒸水中，可水浴加热助溶解，待完全溶解后定容至100ml，过滤除菌，4保存。4) 1M HEPES将 23.83g HEPES 溶解于三蒸水中, 完全溶解后定容至 100ml，高温高压灭菌，4保存。5) 1M KCl将 7.455g KCl 溶解于三蒸水中, 定容至 100ml，高温高压灭菌，4保存。6) 小鼠小脑神经细胞培养基（CVL） （无菌条件下配制） （100ml） H20（无菌） 56.5mlDMEM-F12（5） 25mlL-glutamine 1mlNaHCO3（7.5%） 1.5mlGlucose（30） 2mlHEPES（1M） 0.5mlKCl（ 1M） 2.5mlSerum（FBS） 10mlPenicillin-streptomycin 1ml
