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1、一、Total RNA 的提取：1. 取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min 左右，研磨充分后加入 1.5ml 的 EP 管，加入 1ml Trizol，充分匀浆。 （另一种，加入 trizol 会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。 ）2. 室温静置 10min，12000g ，4 度，5min ，上清转移到新的 1.5ml的 EP 管中3. 加入 1/4 体积的氯仿，振荡混匀，室温静置 15min，12000g，4 度，15min，上清转移至新管；4. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置 10min，12000g，4度，10min5. 弃上
2、清，留沉淀，加入 1ml 的 75%乙醇清洗沉淀， 7500g，4 度，5min，弃上清保留沉淀。重复三次6. 弃上清留沉淀，自然风干（510min） ，加入 32ul DEPC 处理过的水，测 OD260/280 的值，根据结果调整至 1g/l=1000ng/l，立即进行反转录，剩余的 RNA 标好号存放在 -80下。附：1OD260=40g/ml用样本跑电泳，确定 RNA 的完整性，注意在这之前把胶配好。 （可无）可见明显的两条带，并且 28S 是 18S 亮度的两倍，还有下边一条不太明显的 5SRNA 的条带。证明 RNA 完整无降解。二、反转录：说明书：10 l 反应体系可最大使用 5
3、00 ng 的 Total RNA。20/1g（以前用的 40，下次用 20）20ul 的体系：先把 buffer 和 RNase Free dH20 和 enzyme 配成 mix5PrimeScript Buffer（ for Real Time）：4lPrimeScript RT Enzyme Mix I ：1lOligo dT Primer（ 50 M）：1lRandom 6 mers（ 100 M）：1 l总 RNA ：1 l(1g/l)RNase Free dH2O ：12l反转录反应条件如下:37 15 min （反转录反应）85 5 sec（反转录酶的失活反应）4 -20分装保
4、存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）三、内参检测 -actin 50l 体系试剂 使用量10*taq buffer 5ldNTP 4lPrimer-F（100M） 0.5lPrimer-R（ 100M） 0.5lTaq E 0.25l模板500 ng 1l灭菌蒸馏水 加至 50lPCR 反应条件 :扩增 1 kb 的 DNA 片段的 PCR 反应条件如下：预变性：95，3min98 10 sec.55 30 sec.（下次 60，去掉非特异性）72 30 s （对于 80bp 的内参来说是不是可以省去）72 5min.4保存电泳：2% 琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成 20bp 的 marker，不要加太多。四、定量 PCR电泳检测，条件同上。增大至 50 个循环。五、分析数据引物AT1F: GCCCTTCGGCAATCACCTATAT1R: TGAGACACGTGAGCAGGAACAT2F: CCTGGCAAGCATCTTATGTAGTTCAT2R: CCGGAAATAAAATGTTGGCAATACTIN FGCAGATGTGGATCAGCAAGCR GGCGGACTGTTACTGAGCT
