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1、BCA 蛋白浓度测定试剂盒 说明23225 蛋白质化验试剂盒：为 500 试管或 5000 微孔板的检测提供充足的试剂23227 蛋白质化验试剂盒：为 250 试管或 2500 微孔板的检测提供充足的试剂试剂盒组分：BCA 试剂 A， 1000 mL (No. 23225 产品中) 或 500mL ( No. 23227 产品中)，碳酸钠，碳酸氢钠，二喹啉甲酸，酒石酸钠溶于 0.1 M 氢氧化钠中。 BCA 试剂 B , 25 mL, 包括 4%硫酸铜一次性标准白蛋白, 2mg/ mL, 10 1 mL 安瓿, 包含 2 mg/ mL 牛血清白蛋白(BSA) 存在于 0.9% 盐和 0.05%
2、叠氮化钠 中。储存：以上试剂保持在室温下储存和装运注意：如果试剂 A 或 试剂 B 在低温下运输或长期储存时出现沉淀现象，可以通过缓慢加温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时请丢球试剂盒。目录介绍.1准备标准试剂和工作试剂.2准备试管.3准备微型版.3故障检修.4有关美国热电其他产品.5附加信息.5参考文献.6介绍美国热电（Thermo）公司的 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 是基于二喹啉甲酸(BCA)通过比色检测和定量测定总蛋白的洗涤剂兼容配方。该方法通过碱性介质中的一种蛋白结合了 Cu2使其显著减少转变为 Cu1 （缩二脲反应） 。用一种含二奎琳甲酸的试剂选择性的比色法高敏
3、感的比色杯中的 Cu1. 这种测定方法的紫色色反应产物是通过 BCA 的两个分子和亚铜离子螯合作用形成的。这种水溶性复合物在 562nm 处有强吸收峰。在大的活性范围内 (20-2000g / mL）几乎同蛋白浓度增加呈线性关系。BCA 法不是真正的终点的方法 ；也就是说，最终颜色继续发展。孵化之后, 继续的颜色发展速度是足够慢以允许一起进行测定大量样本。大分子结构的蛋白质,肽键的数量和存在的四个特定氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸，色氨酸和酪氨酸)据说是与 BCA 形成颜色产物的原因。因此,蛋白浓度的测量通常要参照标准的一个常见的蛋白质如牛血清白蛋白。一系列已知浓度的蛋白质稀释液是为与之相近的未知蛋
4、白质浓度测定准备的。因为每一个未知浓度的测定都需要基于标准曲线。如果需要将一个未知蛋白精确定量，选择一个与未知蛋白特性相似的标准蛋白是可取的。例如，当测定免疫球蛋白时牛血清丙种球蛋白可以被当做标准蛋白。以下给出了两种检测过程：其中,试管程序需要一个较大的体积(0.1 毫升) 的蛋白质样品。然而 ,因为它使用了一个样品比例为 1:20 的工作试剂(v / v),所以将干扰物质的影响降到最小。在酶处理程序提供了一样品处理酶，需要体积较小(10 -25L)的蛋白质样品。然而,由于使用了样品比例为 1:8 的工作试剂(v / v) ，所以在克服干扰物质浓度时灵活性降低，从而获得的检测水平较低。标准试剂
5、和工作试剂的准备（试验程序需要的两个）A 准备稀释的 BSA 标准液表 1 为导向,准备一套蛋白质标准。稀释标准的内容为,将一个盛在安瓿管中的标准 BSA 稀释到几个洁净的瓶子中,最好使用和样本(s)相同量的稀释剂。根据表 1 的建议：每 1 毫升的 安瓿管中加入 2 毫克/毫升的 BSA 标准液对于准备一系列的标准稀释液是足够的。每个稀释标准重复三次也是足够量的。表一：准备稀释的 BSA 标准液标准试管协议和微型版程序的稀释方案（活性范围=20-2000g/mL）管号 稀释液体积（L） BSA 来源及体积（L） BSA 终浓度（L/mL ）A 0 300 的原液 2000B 125 375
6、的原液 1500C 325 325 的原液 1000D 175 175 的 B 管稀释液 750E 325 325 的 C 管稀释液 500F 325 325 的 E 管稀释液 250G 325 325 的 F 管稀释液 125H 400 100 的 G 管稀释液 25I 400 0 0=空白加强试管协议的稀释方案（活性范围=5-250g/mL）管号 稀释液体积（L） BSA 来源及体积（L） BSA 终浓度（L/mL ）A 700 100 的原液 250B 400 400 的 A 管稀释液 125C 450 300 的 B 管稀释液 50D 400 400 的 C 管稀释液 25E 400
7、100 的 D 管稀释液 5F 400 0 0=空白B：准备 BCA 的工作试剂（WR）1.总共需要的 WR 的体积可以通过以下公式计算出来：（标准液+未知液）（平行数目）（每个样品中加入的 WR 体积）= 总共所需的 WR体积例如：标准的试管程序有三个未知液，每个样品做两组重复：（标准液 9mL+未知液 3 mL）（平行数目 2）（2 mL）=总共所需的 WR 体积 48mL注意：试管程序中每个样品管加 2.0ml WR微型版程序中每个样品中只需要加 200ul WR2、WR 的制备：（BCA 试剂 A:B=50:1） ，对上述样品,将 50mL 试剂 A 与 1mL 试剂 B 混合。注意：
8、当试剂 B 加入到试剂 A 的开始，浊度观察表明：混合后迅速消失变成澄清的绿色的。准备充足的 WR 是基于所测样品数量上的。如果将 WR 储存在处于室温（RT）的密闭容器中，那么几天之内 WR 是稳定的。简要步骤（试管程序，标准方案）混合 WR（50A+1B）充分混合（0.1mL 样品+WR）温育：37,30min.然后冷却分光光度计562nm 读吸光度试管程序（样品：WR =1:20）1、 用移液管移取每个标准品和所测样品的重复 0.1ml 到有标签的对应试管中。2、 在每个管中加 2.0ml 的 WR，混匀。3、 封口，然后温育试管（选择时间和温度）1）标准方案：37 30min(work
9、ing range=20-2000ug/ml)2）RT 方案： RT 2h(working range=20-2000ug/ml)3）Enhanced Protocol(加强方案)：60 30min(working range=5-250ug/ml)注意：每个实验中都增加培育时间和温度，增加的净吸光度，降低试剂的最低检测水平和方案的工作范围；使用水浴加热管要么是标准(37C 培养)或是增强(60 C 培养) 协议。使用强制的培养可能会因为热传递不均匀使其在颜色变化上引进明显的误差。4、 使所有管子冷却至室温5、 分光光度计设定在 562nm，当比色皿中装的是水时给仪器校零。随后，确保在 10m
10、in内测完所有样品的吸光度。注意：因为 BCA 测定不是真正的终点，即使冷却到室温颜色还会继续变化。然而，由于在室温下颜色变化速度比较慢，所以如果在 10min 内测完所有试管的吸光度就不会引进明显的误差。6、 所有的单个标准品与所测的样品重复在 562nm 测得的吸光度都要减去在 562nm 测得的所有空白标准品的吸光度平均值。微型板程序（样品：WR =1:8） 1、 用移液管移取 25ul 的 WR 到每一个标准品与未知样品所在的微型板中（working range=20-2000ug/ml）注意：如果样品大小被限制为：每个未知样品和标准品只能使用 10ul（sample toWR rat
11、io=1:20）.然而，被测量的 working range 在这种情况下将被限制为 125-2000ug/ml。2、 每个孔中加 200ul 的 WR，用 plate shaker 混 30s，使其彻底混匀3、 封口，温育 37 30min 4、 冷却到室温5、 用酶标仪测量在 562nm 或接近 562nm 的读数注意：1）这种方法中波长在 540-590nm 的范围内都能被成功的测量2）因为读板器使用的光线长度比分光光度计的比色皿要短，所以微型板程序需要使用样品比例比较大的工作试剂去获得与标准试管程序相同的灵敏度。如果需要高于562nm 的测量，要将培养时间增加到 2h.3）增加培养时间
12、或样品工作试剂的体积比率，增加每个 well 在 562nm 的净测量值，降低实际的最低测量水平和测量的 working range。只要每个标准样与未知样都被同等对待，这样的修改也是有益的。6、所有的单个标准品与所测的样品重复在 562nm 测得的吸光度都要减去在 562nm 测得的所有空白标准品的吸光度平均值。7、准备一个标准曲线通过绘制每一个标准 BSA 在 562nm 测量的相对于空白对照的吸光度平均值。它 ug/ml 的浓度。使用标曲去测量每一个未知样品的蛋白质浓度。注意：如果联系微型板读数器使用拟合的曲线算法，一个有四个参数的或最合适的曲线将提供比纯线性状态更精确的结果。如果用手绘
13、制这个结果，一个点-分曲线将比线性更加适合标准点。故障检修问题 可能原因 解决方案在任何管中都无颜色 样品包含铜螯合剂 透析，脱盐，或稀释样品。增加工作试剂中铜浓度(例如 ,使用, 试剂A:B 50:2) 使用的产品 23215 从样品去除干扰物质强酸性或碱性缓冲液改变了工作试剂的pH透析，脱盐，或稀释样品。空白吸收是可以的,但是标准和样本比预期的显示更少颜色颜色在错误波长下被测量确定在 562nm 波长下测吸光度蛋白浓度太高 稀释样品添加以减少脂质干扰样品的颜色比预期的深样品包含脂质或脂蛋白 使用的产品 23215 从样品去除干扰物质缓冲液中含有还原剂缓冲液中含有巯基所有试管(包括空白)都是
14、暗紫色缓冲含有生物胺（儿茶酚胺）透析或稀释样品。使用的产品 23215 从样品去除干扰物质需要在不同波长下测量 分光光度计或酶标仪 从 540nm 到 590nm 颜色可以在任何波颜色 没有 562nm 滤光器 长下被测量,虽然标准曲线的斜率和整体测量的灵敏度将减少A：干扰物质某些物质干扰 BCA 检测是已知的，包括潜在的还原剂，螯合剂，强酸或强碱。因为他们可以干扰估算蛋白质每分钟浓度, 作为样品缓冲液的组份应避免下列物质：抗坏血酸 EGTA 铁 不纯的蔗糖儿茶酚胺 不纯的甘油 脂质 色氨酸肌酸酐 过氧化氢 蜜二糖 酪氨酸半胱氨酸 酰肼类 苯酚磺酞 尿酸其他物质对 BCA 法检测蛋白量有较少程
15、度的干扰。并且这些在原来的样本中低于一定浓度只有很小的影响（可以容忍） 。许多物质的最大兼容的浓度在标准测试管协议中被列出。表 2 （见说明的最后一页） 。物质是兼容与标准测试管协议中指定的浓度，如果蛋白浓度的估计的误差是由物质的存在所造成将会小于或等于 10 。在每一个实验之前，这些物质都会用现配的 WR 进行测试。空白校正的宰 562nm 的吸光度测量值（ 1000g / mL 白蛋白标准品+物质）将会同 0.9%生理盐水中精确配制的标准品在 562nm 出的净吸光度进行比较。样品：WR 为 1： 8 (v/v)的微孔板过程中最大兼容浓度将比较低。 B .消除或减少干扰物质影响的 ,策略BCA 蛋白含量测定中干扰物的影响可以用以下几个方法消除或克服。 通过透析或凝胶过滤去除干扰物质。 稀释样品,直到不再有干扰。这种策略只在起始蛋白质浓度足够多余稀释后仍在检测活性范围之内是有效的。 用丙酮酸或三氯乙酸(T
