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1、线粒体凋亡途径的研究进展摘要:线粒体凋亡是细胞凋亡的主要途径之一，是一种由凋亡基因调控的高度保守的死亡过程。大多数凋亡信号作用于线粒体，通过改变线粒体膜的通透性，导致线粒体内相关物质释放入胞质，从而介导线粒体乃至细胞的凋亡，因此线粒体可能在细胞凋亡中起到主开关的作用，并且线粒体凋亡途径受到caspase 家族、Bcl-2 家族、Smac 及 IAP 等的调节。关键词：线粒体；细胞凋亡；细胞色素 C；Bcl-2; MPTP；caspase；AIF；IAP；EndoG；Smac/DIABLOAbstract: Mitochondrial apoptosis is one of the major
2、pathways for apoptotic, and it is a high conservative process which is regulation by apoptosis gene. Most of the apoptosis signal was directed to mitochondria, by changing the permeability of mitochondrial membrane, which is leading to related substances in the mitochondria into the cytoplasm, and m
3、ade the apoptotic of mitochondria and cells. So mitochondria may be master switch in apoptotic, and mitochondrial pathways of apoptosis be regulated by caspase family、Bcl-2 family、Smac and IAP.Key words:mitochondrion； Apoptosis；CtyC；Bcl-2；MPTP；caspase；AIF；IAP ；EndoG；Smac/DIABLO引言凋亡（apoptosis）是一个生理性的
4、细胞自我毁灭过程，并由基因调控的高度保守的死亡过程，它在维持机体内环境的稳定和防御内外伤害等方面起着重要作用。如果机体内凋亡发生紊乱，则可能导致各种疾病的发生。但凋亡与坏死是两个完全不同的概念，凋亡是一个主动过程，它涉及到许多基因的表达和调控，最早是 1972 年由 kerr 教授根据形态学特征而提出的 1。而坏死是一个被动过程，它是指细胞受到外界物理或化学等方面的影响而导致的细胞死亡过程。细胞凋亡途径主要有 3 种通路：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路2，也有学者将内质网通路归纳入线粒体通路之中。而且各种通路之间相互联系，共同介导细胞凋亡，并且在这其中线粒体通路起到决定性作用，被视为在细
5、胞凋亡中起着主开关作用，从而成为细胞凋亡的执行者。因此，研究细胞内线粒体凋亡已成为现代研究的热点。这里我们将就线粒体的功能，以及其在凋亡过程中结构的变化、调控作用及其机制等方面做一综述。一、线粒体的功能线粒体（mitochondria）是德国生物学家 Altmann 1890 年首先在动物细胞内发现，Benda 1897 年命名的 3。线粒体具有氧化磷酸化、转递电子、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用，它为细胞的各种生命活动提供基础能量，细胞生命活动所需的能量约有95来自线粒体，其是细胞内主要的 ATP 生产中心，当其合成 ATP 发生障碍时，则可影响心肌、骨骼肌、肝脏细胞等组织使其发生障碍。
6、并且线粒体对于细胞内 Ca2+浓度起着重要调节作用，它具有二条 Ca2+摄取途径和四条 Ca2+释放途径，也可通过其膜电化学梯度来维持，并为代谢产物的转运提供动力。另外，线粒体在介导细胞信号转导、细胞对环境变化做出各种应激反应、细胞内 pH 值的维持及渗透压调节等方面亦起着非常重要的作用。研究发现，线粒体的另一项主要任务就是在细胞凋亡中起重要作用，它通过自身的凋亡来介导细胞发生程序性死亡，在此过程中线粒体通过对凋亡信号的感知 4，通过一系列的变化从而释放一些蛋白，如细胞色素 C（cytochrome C,Cyt C） 、凋亡介导因子和核酸内切酶等，这些释放物除在胞质中发挥作用介导细胞凋亡外，还
7、可以进入细胞核内，调节相关凋亡基因的表达，产生凋亡效应。二、线粒体凋亡的结构特征在光学显微镜下，线粒体多为杆状、粒状和线状。不同种类细胞和不同生理条件下，线粒体的形状可能不同，其直径一般为 0.5m3.0m，其大小也因细胞种类和生理状况而异。并且在电镜下可以看到，线粒体是由两层单位膜围成的封闭的囊状结构，可以分为外膜（outer membrane） 、内膜（inner membrane） 、膜间腔（inter membrane space）和内室基质（matrix）4 个部分。在线粒体凋亡的前期，线粒体膜的通透性会升高，其通透性由线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeabi
8、lity transition pore,MPTP）调控。MPTP是位于线粒体内外膜之间，由多个蛋白质组成的复合通道，Zamzami 等报道，该复合体至少由外膜的电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel,VDAC） 、内膜的腺苷酸转位子（adenine nucleotide translocator,ANT）及基质的亲环蛋白 D（cyclophilin D）三种蛋白组成 5，它是线粒体与胞质进行信息交流的枢纽，可以通过钙超载和过氧化等途径而活化，被称为细胞的生死开关。在不同的内环境下，MPTP 可有 3 种不同的状态，一种是完全关闭状态，线粒体跨膜电
9、位完整。一种是可逆的低水平开放状态，仅允许分子量小于 300D 的物质通过，线粒体跨膜电位可逆性降低。另一种是不可逆的高水平开放状态，允许分子量小于 1.5KDa 的物质通过，包括质子和水分子,跨膜电位不可逆的降低。如上所述，线粒体凋亡时，其膜的通透性会升高，导致各种凋亡因子释放入胞质，胱天蛋白酶（caspase）被激活，以及细胞死亡。但其通透性升高的确切机制目前尚不十分清楚，最近的研究表明，在线粒体凋亡时，线粒体脂质会发生重新分布，并对膜通透性的升高起着重要作用 6。首先发现的是磷脂酰丝氨酸外翻以及浆膜囊泡形成。最近还发现，当线粒体发生凋亡时，心磷脂水平会降低，而心磷脂是一种带负电荷的主要分
10、布在线粒体内膜上的磷脂，它对于线粒体内氧化磷酸化中的许多蛋白活性和载体都是非常重要的。凋亡时，它会跨膜转向线粒体外膜，通过与 Bcl-2 家族蛋白作用使通透性升高。在线粒体膜通透性升高的条件下，其结构改变的主要特征是由于基质蛋白的高浓度而使线粒体发生肿胀，并可伴有线粒体嵴数减少或消失，当肿胀达到一定程度时，即可出现线粒体外膜（OMM）破裂导致膜间蛋白释放，但内膜并不易破裂，其原因可能是内膜多嵴，其表面积远大于外膜。由于线粒体膜通透性的升高，将导致线粒体内膜原有两侧质子和其他离子的不对称分布消失，从而导致线粒体膜电位的降低或消失。而线粒体膜电位的维持是保持线粒体功能所必需的，所以当膜电位降低或消
11、失后，线粒体的功能将发生紊乱进而导致凋亡的发生。三、线粒体凋亡的调控机制和机体内各种细胞的增殖一样，凋亡也是受到基因调控的精确过程，线粒体凋亡的调控主要是针对线粒体凋亡途径中各种凋亡蛋白及其所形成的各种复合物进行调节，从而达到促进或抑制线粒体凋亡的作用。1.线粒体通透性转换孔（MPTP）的作用：MPTP 是一种调控机构，能够造成线粒体膜电位的降低，线粒体内 Ca2+的减少和内部产生自由基的减少 7，使细胞维持正常的生理功能。MPTP 的调控机制主要有以下几点：质子梯度调控：MPTP 是由质子梯度、基质 pH 和线粒体内膜（IMM）电压差调控，最适宜的该孔道开放的基质 pH 为 7.4，其它 p
12、H 无论低于此值还是高于此值都将造成孔道的开放性下降。Ca 离子调控：通过 Ca2+的内流外放之间的相互转变可以严格调控基质 Ca2+含量，这也是被广泛认同的用于调节 MPTP 开关的机制。MPTP 抑制因子调控：主要包括环孢菌素、米酵母酸。Bcl-2 家族对 MPTP 的调控：如促凋亡蛋白 Bax 可与 ANT 或 VDAC 相互作用促进 MPTP 的开放，抗凋亡蛋白 Bcl-2 则可以与 ANT 相互作用或阻止 Bax 与 ANT 作用而抑制 MPTP 的开放 8。此外，细胞氧化还原水平、能量代谢水平、腺嘌呤核苷酸的耗竭以及无机磷酸盐浓度的升高等都能影响 MPTP 的开放状态。2.各种促凋
13、亡蛋白的释放：这些促凋亡蛋白的作用是非常重要的，在细胞的正常状态下，它们与各种凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins IAPS）共同通过对 caspase 级联反应的促进或抑制来调节细胞的凋亡，使细胞的增殖与死亡保持平衡，如果这些调控因素发生紊乱，则可使细胞过分增殖或过分死亡从而引起肿瘤的发生。（1）细胞色素 c(cytc)的释放：cytc 不仅能够在线粒体的呼吸中起到转递电子的作用，而且作为一个凋亡的起始因子也起着重要作用。当 cytc 释放到胞质后，不仅使线粒体呼吸链、电子转递受阻，能量供应减少，而且 cytc 与（凋亡活化因子-1）Apaf-1、AT
14、P/dATP 结合并发生多聚化从而形成凋亡体，引起Procaspase-9 的活化 9，从而有效的切割和活化下游的效应半胱氨酸蛋白酶，导致凋亡。也有可能在某些细胞中，由于细胞中存在内源性 caspase 抑制剂，释放的细胞色素 C 将无法诱导 caspsae-3 介导的凋亡，而大量的细胞色素 C 释放将导致细胞向坏死的方向发展 10。目前，关于 cytc 释放的机制还不是十分确切，就提出的各种观点来看，主要有两种模式，一种是通过 Bcl-2 家族的促凋亡成员 Bax/Bak 造成线粒体外膜中断，而不影响线粒体内膜或基质的功能，并且 Shimizu 等 12发现在缺乏 VDAC 的细胞中，Bax
15、 不能诱导细胞色素 C 的释放以及线粒体跨膜电位的消失，而在 ANT 缺乏的细胞中则无此现象，这说明 Bax和 VADC 相互作用可能促使 cytc 的释放。另一种是其他信号，如反应应激、Ca2+触发线粒体内膜上的小孔道开放，水分子进入线粒体基质导致外膜破裂 11。（2）凋亡诱导因子 AIF（apoptosis inducing factor,AIF）的释放：AIF 是一种主要的凋亡效应蛋白，由位于 X 染色体一简单基因编码，是一种分子量为 57KD 的双动能黄素蛋白，除具有电子供体/受体功能外，还可独立作用于核染色质，具有促凋亡作用 13。其前体在胞浆合成后转运到线粒体，被线粒体外膜保留在膜
16、间隙，并与热休克蛋白 60（heat stock protein 60,hsp60）共同定位于线粒体，hsp60 被线粒体内膜保留于基质。当线粒体凋亡时，AIF 就从线粒体释放出来，获得能量后直接转运到细胞核，独立的将 DNA 裂解为 60KD左右的片段，引起染色质凝缩和 DNA 的大规模片段化，但 AIF 并不具有核酸内切酶活性，可能与核酸内切酶 G（EndoG）或其它核酸内切酶协同作用。同时也有研究表明，AIF 的重组体能诱导纯化的线粒体中 cytc 及 caspase-9 的释放。许多研究表明，AIF 的释放可以受到 Bac-2 家族、Ca 2+、过氧化氢等的调节，这些调节因素可以使线粒体 MPTP 的孔径变大，释放出 AIF。并且发现 AIF 从线粒体释放是 caspase 依赖的，但其释放后的功能是 caspase 非依赖的，它不能被caspase 抑制剂所抑制。膜间隙中的 AIF 还可通过自身放大回路使线粒体释放出更多的 AIF，后者再作用于其它线粒体，破坏其功能。因
