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1、PCR 引物设计原理、方法及原则PCR 引物设计原理PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为 1530 碱基，扩增片段长度为100600 碱基对。让我们先看看 P1 引物。一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有
2、聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则 P1 引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于 4 个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的 5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但 3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 3端开始的。这里还需提醒的是 3端不要终止于密码子的第 3 位，因为密码子第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。PCR 引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在 1530 碱基之间。 G+C 含量
3、在 40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 引物 5端可以修饰。 引物 3端不可修饰。 引物 3端要避开密码子的第 3 位。PCR 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。如前述，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR 的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA
4、二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为 1530bp，一般为 2027mer。引物的有效长度：Ln=2 （G+C）+（A+T+，Ln 值不能大于 38，因为38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。4.G+C 含量G+C 含量一般为 40%60%。其 T
5、m 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 510。若按公式Tm=4（G+C ）+2 （A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互
6、补碱基不能大于 3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免 3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的 3端引物的延伸是从 3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3端不能发生错配。在标准 PCR 反应体系中，用 2U Taq DNA 聚合酶和 800mol/L dNTP（四种 dNTP 各200mol/L）以质粒（103 拷贝）为模板，按 95，25s；55，25s ；72，1min 的循环参数扩增 HIV-1 gag 基因区的条件下，引物 3端错配对扩增
7、产物的影响是有一定规律的。AA 错配使产量下降至 1/20，A G 和 CC 错七下降至 1/100。引物 A：模板 G 与引物G：模板 A 错配对 PCR 影响是等同的。9.引物的 5端引物的 5端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。PCR 引物设计的 黄金准
8、则1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72 。GC 含量（composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含
9、量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 510。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 5580，其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。4.引物 3端要避开密码子的第 3 位。如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物 3端不能选择 A，最好选择 T。引物 3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱
10、基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G 、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 T。6. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpi
11、n ）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。8. 引物 5 端和中间G 值应该相对较高，而 3 端G 值较低。G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G
12、值越大，则双链越稳定。应当选用 5 端和中间G 值相对较高，而 3 端G 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的G 值可以用 Oligo 6 软件进行分析）9.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+ 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3 端开始的，不能进行任何修饰。3
13、端也不能有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6l kJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
