《探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害》由会员分享，可在线阅读，更多相关《探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害实验目的：此实验采用免疫组织化学法检测 AGEs 在血管壁的分布情况，研究糖尿病动脉粥样硬化血管壁糖化的程度。探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害。（AGEs 是在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生一组稳定的棕黄色的终末产物。）技术路线：1.切片选择：石蜡切片制备程序（取材，固定，脱水，浸透， 石蜡包埋，切片及贴片）A 组（对照组）：非糖尿病者无动脉粥样硬化动脉血管石蜡切片，B 组（实验组）：糖尿病者动脉粥样硬化动脉血管石蜡切片2.抗体选择：一抗兔抗人抗体；二抗碱性磷酸
2、酶标记的羊抗兔抗体3.免疫组织 ABC 法操作程序（1）烤片 温度和时间为 5860,23 小时。(2) 脱蜡和水化 切片在染色缸中分别在二甲苯 和中浸泡 1530 分钟，依次经过下行梯度乙醇至水。在无水乙醇、中分别浸泡 5 分钟，95%、90%、80%及 70%乙醇中分别浸泡 2 分钟，PBS 漂洗 3 分钟3 次，放置蒸馏水中待用。（3） 抗原修复 水浴加热法：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015 分钟。 （4） 细胞膜打孔 切片置于 0.3%Triton X-100 中室温浸泡 25 分钟，PBS 漂洗 3 分钟3次（5）灭活内源性过氧化物酶 左旋咪唑加入底物液中并
3、保持 pH 为 7.6-8.2，可除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用 0.05mol/L 酒石酸抑制。 （6）正常血清封闭液:羊血清 20 ul，室温孵育 15 分钟，甩去多余液体，不洗。（7）滴加一抗（用 PBS 稀释为工作浓度）20 ul 372 小时，PBS 洗 3 分钟，洗涤 3 次。(8）滴加二抗 20 ul 3720 分钟，PBS 洗 3 分钟，洗涤 3 次。 (9)滴加 SABC 液 20ul,37孵育 20 分钟，PBS 洗 3 分钟（3 次）。(10)室温 NBT显色，镜下控制显色程度，显色后蒸馏水或自来水冲洗，染色过程中缓冲液用 0.02mol/L
4、 TBS（pH8.2）。（11）苏木精复染 5-10 秒，自来水反蓝，上行梯度乙醇脱水分别 2 分钟，透明用二甲苯和各 10 分钟，树脂封片后镜下观察。4.显示碱性磷酸酶的方法：可通过靛蓝四唑反应显色，靛蓝四唑反应底物为溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）经酶水解并氧化形成靛蓝，二硝基蓝四唑（NBT）在氧化过程中被还原成不溶性紫蓝色沉淀。钙-祜法：在碱性环境（PH9.29.4）中，碱性磷酸酶奖磷酸盐的底物分解，产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀，因磷酸钙不显色，需要加入硝酸祜，用祜离子置换钙离子，形成磷酸祜沉淀后有硫化氨处理，形成棕黑色硫化祜沉淀，从而显示酶活性部位，硫化祜沉淀的多少鱼
5、碱性磷酸酶含量成正比。偶氮-偶联法：人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。5.结果保存与分析：图像分析的两种方法：1.人工分析：人工计数；着色强度分析。2. 显微图像分析系统:计算机能自动精细处理各种有形的标本图像，它不仅能通过各种成像系统获得图像的几何数据、光密度、灰度等信息，还可运用该系统对获得的信息作进一步处理。AGEs 表达采用半定量分析，即随机选取 10 个连续不重复的视野(x200)，根据血管壁着色情况计算阳性指数(PI)：阳性信号面积 X 阳性强度，求和、取平均数。形态学分析用盲法以减少误差。阳性面积与阳性强度计算方法如下：(1
6、)阳性面积，阴性无着色 0 分，75着色 4 分；(2)阳性强度，阴性无着色 0 分，弱阳性 1 分，中等阳性 2 分，强阳性 3 分。糖尿病粥样硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层 AGES 呈蓝黑色，强阳性反应，而中膜 AGEs 的阳性反应且分布比较均匀，呈条索状。而非糖尿病者无动脉硬化，血管横截面的组织切片上，内膜、内膜下层及中膜 AGEs 呈阴性反应。非糖尿病动脉硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层 AGES 呈阳性反应，中膜 AGES 的阳性反应分布均匀，亦呈条索状6.实验讨论：目前已经发现多种 AGEs 与动脉粥样硬化的发生和发展均有密切的关系。AGEs 可刺激内皮细胞
7、增加诱导型一氧化氮合酶 mRNA 表达，诱导内皮细胞凋亡，促进细胞外基质、促凝血因子、组织因子及血小板与平滑肌细胞接触，引起单核-巨噬细胞迁移，吞噬脂质，启动动脉粥样硬化的病理过程，促进早期动脉粥样硬化斑块形成。糖基化终末产物是还原糖与蛋白质、氨基酸等的游离氨基通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。AGEs 与血管内皮细胞上 AGEs 受体结合后使血管壁通透性增加而不破坏其完整性导致内皮上 AGEs 大量沉积，且使内皮细胞表面抗凝酶的表达减少增加前凝血因子的活性，促进血栓形成。随着 AGEs 在血管壁的沉积它能引起胶原纤维问过度的共价交联，这种交联使胶原纤维对蛋白酶类高度抵抗，降解缓慢，使得胶原纤维在组织中过度堆积，机械强度增加，血管 硬化，顺应性降低。注意事项：1， 载玻片要清洗干净；涂黏片剂防止脱片，做好载玻片的正反面标记；烤片时间要充分、适当，至少 60烤 2 小时以上。2， 脱蜡要彻底，室温较低时可以在温箱内脱蜡，或者延长脱蜡时间。3， 滴加液体，冲洗和擦拭时避免碰到组织切片，操作轻柔，PBS 冲洗要充分。4， 浓缩型试剂稀释后要混匀。抗原和一抗、一抗和二抗的种属关系要匹配。滴加试剂量视组织块大小而定，应覆盖整个组织。5， 切片放于湿盒内，勿使切片干燥。
