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1、1羊水细胞染色体核型分析在产前诊断中的应用作者：代云才 郭渝 胡伟 罗立 张琳琳 【摘要】 目的 探讨羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中的应用价值。 方法 普通培养法对 350 例羊水标本进行细胞培养染色体核型分析。结果 350 例羊水标本一次培养成功340 例，一次培养成功率约 97.1%。其中引产羊水标本 60 例，染色体核型分析未见异常；35 岁或 35 岁以上的高龄孕妇羊水标本158 例，染色体核型分析发现异常核型有 1 例 47，XY,+21 ，1 例47，XXX；1 例 46,XY,15p+。异常核型约 1.9%；产前筛查唐氏高风险孕妇 132 例，核型分析结果异
2、常有 2 例 47，XY,+21 ；1 例46， XY ,t(6;19)（q12;q134） 。异常核型约 2.3%。结论 羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中具有较高的应用价值。 【关键词】 细胞遗传学 产前诊断 羊水细胞培养 染色体核型分析 【Abstract】 Objective To discussion amniotic fluid cell raise karyotype analysis technology in cytogenetics pre-natal diagnosis application value.Methods The ordinary cul
3、ture bottle law carries on the cell culture chromosome analysis to 350 example amniotic fluid specimen.Results 350 cases 2example amniotic fluid specimen one time raises the successful 340 examples, a raise success rate of about 97.1%.And induces labor the amniotic fluid specimen 60 examples, the ch
4、romosome karyotype analysis has not seen exceptionally; 35 year-old or 35 year-old above advanced age pregnant woman amniotic fluid specimen 158 examples, chromosome karyotype analysis abnormal result: 1 example is 47， XY,+21, 1 example is 47, XXX; 1 example is 46, XY,15p+, Abnormal karyotype approx
5、imately 1.9%; Prenatal screening DownSyndrome high risk pregnant woman 132 examples, karyotype analysis abnormal result: 2 example are 47，XY,+21,1 example is 46, XY, t (6; 19) (q12; q134). Abnormal karyotype approximately 2.3%.Conclusion The amniotic fluid cell raise karyotype analysis technology ha
6、s the high application value in the cytogenetics pre-natal diagnosis. 【Key words】 Cytogenetics Prenatal Diagnosis Amniotic Fluid Cell Culture Karyotype Analysis 羊水细胞培养染色体分析技术是细胞遗传学产前诊断的金标准。但在羊水细胞培养过程中，存在易污染、染色体标本片的制备难度大，分裂相较少，对操作人员的素质和技术要求高等问题，难以在基层临床实验室普及和应用。羊水细胞培养染色体核型分析是产前3诊断胎儿染色体病的主要手段，我们为了掌握该分析
7、技术，经两年的研讨，已将该技术运用于细胞遗传学产前诊断。现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 试剂 (1)羊水培养基； (2)25cm2 羊水培养瓶；(3) 低渗液；(4)秋水仙素为 10g/ml；(5) 其他试剂为磷酸盐缓冲液、牛胰蛋白酶、吉姆萨染液。 1.2 仪器 (1)CO2 恒温培养箱；(2)BCM-1000 型生物净化工作台；(3)离心机；(4) 恒温干燥箱；(5) 恒温水箱；(6) YJTF-2A 型通气柜; (7) OLYMBUS BX51 型倒置显微镜；(8)显微成像染色体分析系统。 1.3 羊水标本 (1)羊水标本均来自我院 2007 年 12 月-2009 年12 月
8、经引产、产前筛查和产前诊断的孕妇，年龄 19-45 岁，共350 例。其中引产孕妇 60 例，孕期 19-28 周；高龄孕妇（年龄35 岁）158 例，孕期 17-24 周；产前筛查高风险孕妇 132 例，孕期 17-24 周。 (2)羊水采集:经 B 超定位后，常规消毒，采用 22 号 PIE 穿刺针穿刺，最初用 5ml 注射器抽取约 2ml 羊水弃去，再换 20ml 注射器抽取羊水约 20ml，无菌操作注入 2 个一次性使用无菌刻度离心管中，盖好管帽，立即送实验室接种培养。(3)羊水标本状态：严重血性羊水标本 15 例，正常羊水标本 335 例。 1.4 方法 普通培养法: 将采集的羊水离
9、心沉淀，再将其沉淀物转4入羊水培养瓶内，并加入一定量的羊水培养基进行培养。经更换培养液、再培养后，羊水细胞生长良好，此时，向培养瓶内加入一定量的秋水仙素，使羊水细胞的分裂停止在其分裂中期，再经低渗、固定、制片、显带、染色处理，即可得到可用于染色体核型分析的羊水细胞标本片。羊水细胞传代：用无菌吸管吹打待传代的培养瓶内的活细胞，使其在外力作用下脱离培养瓶底，并悬浮于培养液里，然后将该培养液直接转入新的培养瓶内进行传代培养，培养 3-5 天后即可换液，再培养 3-5 天后羊水细胞生长良好，收获可得到理想的染色体分裂相。 2 结果 共 350 例羊水标本，一次培养成功 340 例，一次培养成功率97.
10、1%。其中引产 60 例，一次培养成功 59 例，一次培养成功率98.3%。羊水细胞核型分析结果未见异常；唐氏筛查高风险 132 例，一次培养成功 128 例，一次培养成功率 97.0%。羊水细胞核型分析结果 2 例 47,XY,+21, 1 例 46,XY,t(6;19)(q12;q134)；35 岁或以上158 例，一次培养成功 153 例，一次培养成功率 96.8%。羊水细胞核型分析结果 1 例 47,XY,+21，1 例 47,XXX，1 例 46,XY,15p+。 3 讨论 羊水细胞培养、染色体标本片的制备难度大，技术要求高。要制作出较好的羊水细胞染色体标本片，首先要保证羊水培养成功
11、。我们的一次培养成功率约为 97.1%。要保证羊水培养具有较高的成功率，必需掌握下列关键技术：(1)无菌操作技术：实验室微生物污染5是细胞培养中的难题之一，所以从羊水标本的采集、离心沉淀细胞、接种培养、换液、传代等每一操作步骤都须要严格无菌操作，避免微生物污染才能保证羊水细胞培养成功。(2)被血液稀释的羊水标本的处理技术：据文献报道，不同的实验室处理方法也不尽相同。我室对血液严重稀释的羊水标本加入适量抗凝剂以防止红细胞凝集而不做其他任何特殊处理，与一般羊水标本一样培养到 6-8 天后换液，用无菌生理盐水洗涤 2-3 次后，再加羊水培养基 3ml，3-5 天后羊水细胞生长良好，收获可得到理想的染
12、色体分裂相。据文献报道红细胞的存在会影响羊水细胞的生长，但我们的检测结果未证实这点。(3)羊水细胞传代技术：一般采用胰酶消化法传代。我室采用无菌吸管吹打法传代。这可避免因过多的操作环节造成的污染。(4)羊水细胞的收集：一般采用胰酶消化法收集羊水细胞。我们采用一次性使用弯曲吸管吹打、刮取贴壁生长的羊水细胞，使其脱落，然后将其收集于刻度离心管内。 在我们的研讨中有 1 例孕期 28 周的羊水标本一次培养未成功，原因可能是孕期超过 25 周后，羊水中的有毒物质如胎脂、胎粪等增多，这些有毒物质要抑制羊水细胞的贴壁生长，使羊水培养不成功。1 例产前筛查高风险羊水标本二次培养未成功，可能与其羊水中活细胞相
13、对减少有关。 羊水细胞来源于胎儿，因此，羊水细胞培养染色体核型分析就是对胎儿染色体核型分析，可对胎儿是否患有染色体病做出明确诊断,达到产前诊断的目的。染色体病是由于染色体数目或结构异常而发6生的疾病，染色体数目异常比结构异常更为常见。我们的检测结果既有染色体数目异常如 47，XY,+21， 47，XXX ；又有染色体结构异常如 46，XY，t(6;19)（q12;q134） 。在数目异常中主要是 21 三体，称为先天愚型。胎儿多余的 21 号染色体破坏了基因组遗传物质间的平衡，导致出生后发育异常。其临床表现多样，以智力低下最为突出。该病是细胞遗传学产前诊断中最常见的疾病，其在新生儿中的发病率为
14、 1/600，而我们检测胎儿的结果是 3/350。其次为性染色体数目异常，如 47，XXX。我们的检测结果是 1/350。染色体结构异常中最常见的是染色体易位，易位又分为平衡易位、罗氏易位和单向易位。如我们检测到的 46，XY，t(6;19)（q12;q134 ）属于平衡易位。这在各号染色体间均可发生，新生儿的发生频率约1-2/1000。平衡易位携带者虽然表型正常,但其可产生异常的精子和卵子, 当异常的精子或卵子与正常的卵子或精子结合后,即可产生染色体异常的胚胎,从而导致染色体异常儿的出生。46,XY,15p+，一般认为如果胎儿父母之一为 15p+，胎儿 15p+属正常，我们对胎儿的父母做了血
15、液染色体核型分析，结果未见 15p+，那么胎儿 15p+从何而来！这只能认为异常。 综上所述，只要能保证羊水细胞培养成功，并制作出较好的染色体标本片，就能对胎儿羊水细胞染色体是否存在数目异常或结构异常做出明确诊断。因此，羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中具有较高的应用价值。 参 考 文 献 71CastroVolio I, SanderMangelK, VargasPradoM, et al. Cytogeneti-cal prenatal diagnosis by amniocentesis during the II and III gestationtrimesters
16、 in Costa RicaJ.Rev BiolTrop, 2001, 49: 1227-1236. 2郑育红,孙筱放, 孙小蔓.原瓶传代培养应用于羊水产前诊断中的研究J.中国优生与遗传杂志 ,2002,1(6):58-59. 3TurhanN0,ErenU,SeckinNC.Second-trimestergeneticamniocente-sis:5-year experienJ.ArchGynecolObstet，2005，271 ：19-21. 4李从青,丛林, 姚洁等.117 例羊水细胞培养结局及影响因素的探讨J.安徽医科大学学报 ,2009,(06):769-771. 5剡红民,强荣, 陶囡等.羊水细胞培养技术在产前诊断的应用J.实用医技杂志，2006(23):35-37. 6刘晓翌，肖晓素，樊尚荣等.羊水细胞染色体制备方法的研究 J.中国妇产科临床杂志，2004(4):296-300. 7林壮.产前诊断羊水细胞培养分析 J.中国现代药物应用，2
