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1、生物光子学大作业作业名称：荧光寿命成像技术 FLIM姓名：曾扬舰学号：13050120080完成日期：2016.6.28荧光寿命成像技术 FLIM摘要：荧光寿命显微成像技术（FLIM）技术是一种新颖的荧光成像技术，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，是生物医学工程领域的研究热点。频域调制、门控探测和时间相关单光子计数是 FLIM 的几种主要实现方法。综述了这些计数的原理、研究现状和已取得的部分成果，比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。宽场 FLIM 更适用于延时成像和实时成像。荧光偏振各向异性成像和内窥镜 FLIM 技术都是 FLIM 技术很有前景的应用方向。Fluores
2、cence Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes
3、within microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenviron
4、ment, and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires a modulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffren
5、ce in phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发平均停留的时间，处于激发态的荧光分子在从激发
6、到基态的过程中发射荧光释放能量。荧光寿命是荧光物质固有性质，与浓度，光漂白和激发强度无关，依赖于围绕荧光物质的离子和局部环境，比如蛋白质的束缚等。影响荧光寿命的因素：荧光物质的结构；所处微环境的极性、温度、粘度，键合离子等条件有关。荧光寿命成像可以区分荧光物质浓度和淬灭效应的影响，这使得荧光寿命成像显微学成为一个有力的工具进行细胞内的定量环境和分子动力学分析。荧光寿命成像技术有两种：时间域和频率域。（1）时域 FLIM：需要脉冲光源，所以一般在双光子的系统上比较常见，因为激光是脉冲的而且买双光子的老师一般也搭配一个 FLIM。光路调节也是一个问题，提供的厂家一般是 Becker&Hickl 和
7、 PicoQuant 德国公司。这个方法比较流行，也有很多系统。（2）频域 FLIM：需要一个相位调制的光源，有用 LED 调制的，荷兰的Lambert-Instrument 就有这样一套产品，是在荧光显微镜上搭的。2、 FLIM 技术的分类及总体进展荧光发射后会以指数规律衰减。荧光寿命通常定义为荧光强度降至最大值的 1/e 时所需要的时间，常用 表示。由于荧光分子所处环境的不同，荧光发射可分为单组分和多组分两类，最简单的情况即单组分下，荧光信号衰减可表示为 如果有大量处在相似环境里的荧光分子被激发，)/exp(0tI那么发射荧光的衰减遵循单指数规律。典型的荧光信号通常都是多组分，即多指数衰减
8、规律。FLIM 技术发展到现在，形成了频域和时域两大类方法。其中门控探测、时间相关单光子计数和扫描相机成像是三种主要的时域实现方法。国际上从 20 世纪 80 年代开始荧光寿命成像发面的研究工作。较早从事荧光寿命成像技术方面的研究工作是日本大阪大学，他们提出的频率调制法来进行荧光寿命的测量。频率调制法原理清晰，设备要求低，系统简单而且造价低，技术也日趋成熟。睡者生物医学测量的需要，可进行纳秒、皮秒量级荧光寿命成像的实时时域 FLIM 技术随后兴起，具有成像速度快，时间分辨率高等优点。TCSPC 是一种经典的光子测量技术，在目前时域 FLIM 中应用最广泛，技术也很成熟。与此同时，时间分辨率不及
9、 TCSPC，但成像速度更快的门控 FLIM 技术逐渐成为 FLIM 领域的研究热点。3、条纹相机方法测量荧光寿命工作原理：条纹相机把荧光中的时间信息转化为空间信息的装置。典型的条纹相机由条纹管、快速扫描电极、输入和输出装置。条纹相机主要是用来测量超快荧光。由超短光脉冲诱导的、从样品发出的荧光被聚焦在条纹相机的光阴电极上，从光阴电极上释放的光电子流量与聚焦在光阴电极上的荧光强度成比，这些电子在加速电场中被加速，然后在偏转电场中被偏离，最后入射到荧光屏的磷光粉上。因此，在不同的时刻，从光阴电极上释放出来的光电子入射到荧光屏上位置也不同。这样在荧光屏上就可以看到一条条轨迹或者称之为条纹，这些条纹的
10、空间分辨率直接对应于荧光的时间分辨率。类型细分为飞秒条纹相机，大动态范围条纹相机，帧条纹相机，X-射线条纹相机等。4、频域 FLIM 技术频域 FLIM 使用正选调制的激光器或者发光二极管 LED 作为光源对样品进行激发，样品会产生与激发光同频率但相位差为 的荧光信号然后使用同频率调制的 CCD 或者 PMT 作为探测器解调并接收荧光信号，通过测量解调系数 M，即可计算相应的荧光寿命 和 。 M国际上对频域 FLIM 的研究开展较早。如何提高成像速率成为频域 FLIM技术首先需要解决的问题。1999 年，瑞士环境工程研究所 Mizeret 等实现了视频速率的内窥镜频域 FLIM 成像，将其应用
11、到了医疗诊断领域， 2000 年，伊利洛伊大学厄本那分校 Holub 等实现了帧频 55Hz 的频域，是当时最快帧频。2004 年，新加坡南洋理工大学 Seah 等使用频域 FLIM 完成了对潜在指纹的识别。5、时域 FLIM 技术时域 FLIM 通过脉冲激光器激发荧光团，利用探测器等直接探测荧光衰减信号=C1tan=1121M=/成像。时域设备与频域相比，通常有更快的成像速度和更高的时间分辨率，因此对设备要求更高。TCSPC 有理想的光子计数率和超高的时间分辨率，与门控探测相比，可测量更短的荧光寿命。门控法的荧光寿命分辨率虽不及 TCSPC，但图像获取速度通常很快，是实现非稳态过程探测的有力
12、技术手段。5.1 时间相关单光子计数5.2 门控探测左图为理想的单指数荧光衰减曲线，在激发光 E(t)作用下，荧光团发射荧光，荧光强度 F(t)与时间 t 关系可表示为 F(t)= exp(-t/ ) ，荧光寿命可通过在0 两个不同时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得。在条件允许下，通常采用多门探测。一个典型的设置为：取三个不同的延迟时刻，每个门记录 15 幅图像某一段时间内检测到发射光子的概率与此时段内的荧光强度成正比，通过测量探测荧光强度的衰减即可实现荧光寿命的探测。TCSPC 基于上述原理实现，构造出如右图荧光发射光子在时间轴上的概率分布曲线，即荧光衰减曲线。由于每个周期只记录
13、一个光子，成像速度慢成为 TCSPC 最大缺点。TCSPC 的时间分辨率很高，通常只受探测器渡越时间限制。 右图是个典型的门控荧光寿命成像系统简图。通常由激发光源、光电探测器、延迟装置及图像处理设备组成门控装置的光源通常为短脉宽超快激光器，以提高生物样品成像的寿命分辨率。CCD 是常见的成像设备，CCD 门宽对成像精度的影响还需要深入研究。延迟装置提供 FLIM 的控制信号。荧光强度图像生成寿命图像的方法有两种：RLD 和 WNLLS。6、宽场 FLIM 系统描系统。宽场系统缺点在于其成像深度小与扫描系统，无法得到样本深层的图像，可通过其他手段得到改善。7、 FLIM 技术与癌症诊断癌细胞的自
14、荧光特性与正常组织有较大差异，同时也可用于区分癌细胞的不同生长周期。其自荧光特性之一的荧光寿命提供了癌症诊断的新依据。近年来，国际 FLIM 研究热点纷纷集中在 FLIM 对癌症的辅助诊断上，研究方向逐渐由体外病理检验向体内诊断治疗发展。内窥镜是临床诊疗，特别是胃癌、食道癌诊断中非常重要的手段。因此 FLIM 与内窥镜的结合，将极大发挥其对癌症组织的精确定位的优势。实时成像在内窥镜诊断中是非常有必要的。8、 FLIM 技术的应用1）细胞体自身荧光寿命分析2）自身荧光相对荧光标记的有效区分3）具有相同频谱性质的不同荧光标记的区分宽场 FLIM 是宽视场的荧光寿命成像显微镜，右图给出了宽场显微镜与
15、扫描显微镜的对比。 ，宽场 FLIM 优势在于较弱的荧光团光漂白效应和较快的系统成像速度，相同探测率下，所需要的激发光要小的多，则样品受到光漂白的影响会小于扫描系统。宽场系统缺点在于其成像深度小与扫描系统，无法得到样本深层的图像。4）活细胞内水介质的 PH 值测量5）局部氧气浓度测量6）活细胞内钙浓度测量7）时间分辨 Forster 共振能量转移（Fret ）：纳米级尺度上的远程测量，环境敏感的 FRET 探针定量测量。总结：在各种 FLIM 方法中， TCSPC 的时间分辨率最高，文献报道可达25ps，门控 FLIM 仅此于 TCSPC，可进行纳秒量级的寿命测试。但在成像速度上，门控 FLI
16、M 是最快的，文献报道帧频可达 100Hz。频域 FLIM 的成本最低，应用最广泛，但其性能指标均不及 TCSPC 和门控 FLIM 为主的时域方法。宽场FLIM 可实现更快的帧频，更适合应用门控 FLIM。内窥镜 FLIM 有广阔的医疗应用前景，可用于癌症等疾病的早期诊断。参考文献：1、Li Dongxu , Xu Xiao , Li Na et al. Time resolution fluorescence technology and fluorescence lifetime measurementJ.University Chemistry, 2008, 23(4):211李东旭，徐潇，李娜等.时间分辨荧光技术与荧光寿命测量J.大学化学，2008，23(4):2112、陈同生，王岩等. 利用基于扫描相机的荧光寿命成像显微技术研究细胞周期J.中国
