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1、1红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究【摘要】 目的 研究一种从红芸豆中提取红细胞凝集素单体(PHA-E)的新方法。方法 红芸豆经过浸提，离子交换树脂分离，分子筛层析纯化后得到 PHA-E 样品。采用电泳法测定其纯度、分子量和等电点。用 2%人细胞悬液测定样品凝集红细胞的能力和影响凝血的因素，使用硫酸苯酚法测定其糖含量。结果 经 PAGE 分析 PHA-E 样品为单带电泳纯，SDS-PAGE 上显示亚基分子量为 32 kD，等电点为6.5.样品使人红细胞 50%凝集的蛋白质最低浓度为 4 g/ml 左右。单糖不影响 PHA-E 凝血活力，EDTA 抑制其凝血活力，Zn2+促进其凝血。糖含
2、量为 8.1%. 【关键词】 红细胞凝集素 分离纯化 凝血 性质研究Abstract：Objective To study a new method for Erythrohemagglutinin（PHA-E ）production from Phaseolus vulgaris.Methods PHA-E was purified from the excellent seeds of Phaseolus vulgaris by extraction，ion exchange chromatography and final gel filtration chromatography.Th
3、e purity,the molecular weight and the isoelectric point of purified PHA-E were determined by electrophoresis.The ability and the influencing factor of agglutination were 2determined by 2% erythrocytes of human.Conclusion The purified PHA-E was single PAGE outline and had apparent subunit molecular w
4、eights of 32 kD by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.Isoelectric point of the PHA-E was 6.5.PHA-E can promote agglutination of human erythrocytes at 4 g/ml,but its activity was not inhibited by any monosaccharide.EDTA can inhibit the ability of agglutination,and Zn2+ can accelerate it.The sugar
5、 content of PHA-E was 8.1%.Key words:erythrohemagglutinin；separation and purification；haemagglutination；characterization植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质1 。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA 合成和有丝分裂 2 ，促进免疫反应，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。文献3报道 PHA 是由 E、L 两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为 L4、L3E
6、、L2E2、LE3、E4 具有相同物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中 PHA-E 含有 4 个相同的 E 亚基，具有最强的红细胞凝集功能，没有白细胞凝集能力。由于凝集素单体较混合物 PHA 对于糖链具有更加特异的识别能力，可3以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等，在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。关于红细胞凝集素单体的分离纯化国内还未见报道，本研究改进和优化前人的提取和纯化方法，简化操作程序，从红芸豆中得到了凝血活力较高的电泳纯红细胞凝集素单体。1 材料与方法1.1 仪器与试药UV1102 紫外可见分光光度计（上海天美科技
7、有限公司） ，蛋白质纯化系统（上海琪特仪器分析有限公司） ，高速冷冻离心机（Eppendorf 公司） ，MINI-PROTEIN 电泳系统（Bio-Rad 公司）。红芸豆（购自甘肃兰州） ，低分子量蛋白标准（上海东风生物技术有限公司） ，蛋白质等电点标准（Pharmacia 公司） ，两性电解质（pH 39，Pharmacia 公司） ，PHA-E （Sigma 公司） ，DEAE-Sepharose FF、CM-Sepharose FF、Sephadex G100（Pharmarica 公司） ，乙酰氨基葡萄糖（Sigma 公司） ，人红细胞悬液由本实验室自制，其它试剂均为国产分析纯。41
8、.2 PHA-E 提取过程1.2.1 PHA-E 粗提液制备 将红芸豆粉碎，取 100 g 粉末，加入1000 ml 的 NaAc-HAc 缓冲液(pH 5.2， 20 mmol/L,0.14 mol/L NaCl),分四次磁力搅拌浸取。合并浸取液，后用两层纱布过滤。收集滤液，调 pH 5.2，在 4下 10 000rpm 离心 10min，取上清液，即得 PHA-E 粗提液。1.2.2 CM-Sepharose 层析 取 CM-Sepharose 装柱(2.6 cm20cm)，用 NaAc-HAc 缓冲液（pH 5.2，20 mmol/L）平衡，将收集的 PHA-E 粗提液上柱。用 Na2H
9、PO4-NaH2PO4 缓冲液（pH 6.0，20 mmol/L）冲洗至没有蛋白质流出，再用Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液（pH 7.2，20 mmol/L）洗脱，收集蛋白质峰，调 pH 7.2.1.2.3 DEAE-Sepharose 层析 取 DEAE-Sepharose 装柱(2.6 cm25 cm)，用 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)平衡，将 1.2.2 收集得到的蛋白质峰上柱吸附，用缓冲液冲洗至基线平衡。用含 00.4 mol/L NaCl 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)进行梯度洗脱，
10、流速为 5 ml/min，收集活性峰，装入透析带中，4冰箱中 PEG 浓缩。51.2.4 Sephadex G100 层析 取 1.2.3 中的 PEG 浓缩液，上已经平衡好的 Sephadex G100 层析柱(2.6 cm100 cm)，上样量为 5 ml，用 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)）进行洗脱，流速为 2 ml/min，收集活性峰，用纯水透析除盐后，冻干，即得 PHA-E 单体。1.3 分析方法及性质研究1.3.1 凝血活力测定 按照文献方法4在微量 V 型血凝板上进行，用生理盐水倍比稀释凝集素，每孔含稀释液 40 l，加入 2%人红细胞
11、悬液 40 l，振荡混合，在 25下放置 2 h，肉眼观察结果，凝集活力以 50%人红细胞凝集所需凝集素的 g 数表示。1.3.2 PHA-E 凝血活力影响因素测定 依上法，参考文献5，6 ，PHA-E 倍比稀释后，每空加入 20 l，同时加入 20 l EDTA、二价金属离子或单糖等待测物质溶液，37下孵育 1 h，用上述凝血活力测定方法进行评价。1.3.3 蛋白质含量测定 以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝G250 测定方法7 。1.3.4 蛋白质亚基分子量测定 参照文献8进行，使用不连续6电泳（SDS-PAGE） ，凝胶浓度为 12.5%，pH 8.3.考马斯亮蓝 R-250 染色。1
12、.3.5 蛋白质等电点的测定 参照文献8进行，将样品和 pH 310 等电点标准在 pH 39 胶上进行电泳，经考马斯亮蓝 R-250染色后，量取标准蛋白带和样品的泳动距离，测定样品的等电点。1.3.6 PHA-E 纯度测定 参照文献8进行，使用不变性电泳PAGE，用 PHA-E 标准品做对照，测定其纯度。1.3.7 糖含量测定 参考文献方法9 ，以苯酚硫酸法测定，以葡萄糖为参照物做标准曲线，求得值以 0.9 的系数修正。2 结果与分析2.1 PHA-E 的提取文献3报道，PHA-E 分子量为 128 kD，等电点为 pI 6.5.通过粗提取和 CM-Sepharose 层析，有效的除去了核酸
13、和多数杂蛋白，将 PHA-E 主要集中在 pH 7.2 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液中。洗脱液上 DEAE-Sepharose 柱后，梯度洗脱获得 2 个峰（见图 1） ，其中蛋白质峰 A 具有较强凝血活力。收集峰 A，浓缩后进行分子筛层析，得到两个峰（见图 2） ，其中峰 b 具有凝血活力。收集峰 b，7透析脱盐，冻干后得到白色粉末，即为 PHA-E 纯品。2.2 凝血活力测定纯化得到的 PHA-E 产品，在微量 V 型血凝板上进行凝血活力测定。无凝集时红细胞沉于“V”图 1 DEAE-Sepharose 层析图Fig.1 Ion exchange chromatography
14、 of PHA-E on DEAE-Sepharose图 2 Sephadex G100 层析图Fig.2 Gel filtration of PHA-E on Sephadex G100型孔底部，呈一小圆点；凝集时红细胞相互聚集形成一片网络状，红细胞不下沉。不同的凝集程度用数字表示如下：O(不凝集)：红细胞全部沉积于“V”型孔底部，呈边缘清晰的小圆点； 1(少许凝集)：沉积范围比半凝集大，未遍及全孔；2(半凝集) ：部分沉积中部，周围有浑浊带，约占孔面积的 50%；3(大部分凝集) ：少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊；4(全凝集)：红细胞相互聚集形成一片网络，红细胞不下沉。凝集效价的判定以“
15、2” 作为终点。实验中 PHA-E起始浓度为 200 g/ml，倍比稀释得到 200 g/ml0.75 g/ml8浓度范围（19 号孔）的样品，以生理盐水作为空白（ 10 号孔） ，PHA-E 标准品为对照（起始浓度为 200 g/ml,凝血活力为 8 g/ml） ，测得 PHA-E 的凝血活力为 4 g/ml.实验结果见图 3 和表1.表 1 红细胞凝集结果示意图2.3 凝血影响因素结果见表 2，葡萄糖、半乳糖不影响 PHA-E 凝血活性，EDTA抑制其凝血，Zn2+促进凝血。其他二价金属离子对 PHA-E 凝血活力未见明显影响。表 2 EDTA、二价阳离子和单糖对 PHA-E 凝血活力的影
16、响2.4 电泳性质测定所得产品 PHA-E 在 12.5%凝胶浓度的 SDS-PAGE 上表现为单带，分子量为 32 kD 电泳位置与标准品 PHA-E 一致(见图 4)。在PAGE 上表现为单带，位置与标准品一致，结果见图 5。在 IEF 上表现为两条带，主带位置为 pI 6.5，与标准品位置一致(见图 6)。以上电泳分析证明，分离得到的产品 PHA-E 纯度达到电泳纯，电泳性质与标准品一致。3 讨论9植物血细胞凝集素 PHA 是由五种四聚体糖蛋白组成的混合物，组成的蛋白质等电点在 5.46.5 之间。其中 PHA-E 的等电点最低，为 pI 6.5。目前文献报道主要是通过亲和层析10，11 、盐析和离子交换树脂结合12来进行凝集素的纯化。亲和层析提取PHA，然后再纯化得到各个单体，操作步骤虽然简单，但是亲和介质价格昂贵且重复使用率低，产品质量虽然很好，但是成本较高。普通生产采
