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1、1,纯化篇鉴定篇,蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。首先要根据它的基本性质进行分离纯化，最终对其纯品进行分析鉴定。,2,蛋白质鉴定的主要参数蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。(1)蛋白质的质量鉴定(分子量)(2)蛋白质带电性鉴定（等电点）(3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体结构、肽谱、N和 C-末端)(4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学)(5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）,3,1 蛋白质
2、分子量测定 早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行测定，目前采用的不多了。 葡聚糖凝胶层析介质(Sephadex G系列产品)及排阻层析技术问世以来，被广泛应用于蛋白质的分子量测定。是目前实验室测定蛋白质分子量常用技术之一。但这种层析介质刚性较差，层析过程流速较慢，分离时间长。 新型刚性耐压凝胶层析介质，被用于高效液相色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。,4,随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，SDS-PAGE电泳成了常用的方法。从90年代初期随着毛细管电泳的出现，应用毛细管电泳无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好
3、的选择。 蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展，给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其是采用电噴质谱测定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广，是一种快速精确的好方法。 蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致分电泳技术，层析技术，光谱分析技术。,5,6几种测定蛋白质分子量方法的比较,6,2 蛋白质的等电点测定技术(1) 等电聚焦电泳(Isoelectrofocusing,IEF)(2) 聚焦层析(chromatofocusing)(3) 离子交换层析 离子交换柱 平衡 上样 pH梯度洗脱 测定洗脱峰pH值,7,第十八章 电 泳,8,Electrophores
4、is,Separation in an electric field电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。,9,电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。,10,电泳技术的发展过程,电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，
5、建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、1、2、和球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。,11,1809年俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓
6、性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。,12,从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，以支持介质为主的电泳模式不断涌现（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等).60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。,13,由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展.
7、多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，采用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。,14,电泳的分类,电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。,15,电泳仪：根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS
8、-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。,16,17,电泳槽： 根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽Tiselius设计的自由界面电泳槽（下图）是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽
9、的原理而设计的。,18,3 Tiselius自由界面电泳装置示意图,19,(2)管状电泳槽50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。,20,圆盘电泳槽,21,(3)板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同
10、一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。,22,垂板电泳槽 转移电泳槽,平板电泳槽 双向电泳槽,23,电泳的分类按分离原理分类(1)区带电泳(zone electrophoresis，ZEP)：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图3-2a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。,24
11、,(2)移界电泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图3-2b)。(3)稳态电泳(steady state electrophoresis)：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)(图2c、2d)。,25,a b c d,图3-2 各种电泳分离原理示意图a 区带电泳 b 移界电
12、泳 c 等速电泳 d 等电聚焦,26,按电泳方式分类(1)端电极电泳：有垂直式和水平式两种方式，多用于蛋白质电泳。(2)搭桥电泳：为水平式，水平板状电泳槽形式多样，凝胶和缓冲液通过间接接触的方式，如用滤纸桥搭接，用缓冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接（下图），后两者即半干技术，多用于免疫电泳、等电聚焦。,27,A B C,图4 水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式A 滤纸桥 B 凝胶条 C 滤纸条(3)潜水电泳：为水平式，电泳时凝胶浸于缓冲液中，多用于核酸电泳。,28,6.2支持介质的分类电泳的固体支持介质可以分为两类:(1)薄膜类： 薄膜类包括纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄膜等. 这类支持介质化学
13、惰性好，在电泳过程中产生的对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。,29,(2)凝胶类：凝胶类包括淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。 这类介质相对薄膜类又了进一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因而能产生分子筛效应(molecular sieving effect)，其分离作用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小，对分离不同相对分子质量的生物大分子极为有利。所以，生物大分子如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质量难以控制
14、，操作繁琐，分辨率低，实验室中已很少使用，现在用得最多的是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。,30,按分离原理分类(1)净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(3)聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳；(4)聚丙烯酰胺凝胶双向电泳；(5)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦；(6)聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳；(7)琼脂糖凝胶水平电泳；(8)琼脂糖凝胶脉冲电泳；(9)琼脂糖凝胶免疫电泳。,31,电泳装置的附属设备 随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统
15、、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。,32,33,34,主要内容,基本原理蛋白质电泳核酸电泳,35,第一节 基本原理第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳第四节 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳第五节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦第八节 双向电泳第七节 印迹法（转移电泳）第三节 核酸电泳第六节 毛细管电泳,36,第一节 基本原理,在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度、解离趋势等影响外，还与其它外界环境因素有关。 1 电场强度的影响： 电场强度是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。,37,2 溶液pH值的影响： 大部分生物大分子都具有阳离子和阴离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的pH值决定被分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷取决于环境的pH值。pH影响着生物大分子的电泳迁移率，溶液的pH值距离蛋白质的等电点pI越远，蛋白质带电性越强，泳动速度越快；pH值距离蛋白质的pI越近，蛋白质带电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持pH恒定，必须采用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适pH的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大差异，有利于彼此分开。,
