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1、基于 cDNA-AFLP技术分析半膜覆盖下玉米大喇叭口期基因差异表达 高海荣 李倩 王玉芬 郭九峰 马梦宇 李玉东 白岚方 内蒙古大学生命科学学院 内蒙古大学物理科学与技术学院离子束生物工程重点实验室 摘 要： 为了探讨半膜覆盖调控玉米生长的差异表达基因及分子机制, 以浚单 29为材料, 露地栽培作为对照, 与半膜覆盖间隔种植, 利用 cDNA-AFLP技术, 采用90对单引物筛选半膜覆盖下差异表达基因, 并进行生物信息学分析。结果表明, 利用 90对单引物组合共扩增出 2 298条差异片段, 其中上调表达的有 1 429条, 占总条带数的 45%;下调表达的有 869条, 占总条带数的 23
2、.7%;无差异表达的有877条, 占总条带数的 27.6%。选择重复扩增稳定的 20条差异片段进行回收测序, 经过 Blast数据库对比和基因注释分析, 再将所得的 15条差异片段按功能分为细胞骨架相关基因 (13.3%) 、能量代谢相关基因 (13.3%) 、细胞挽救和防御相关基因 (6.7%) 、转录过程相关基因 (40%) 、胞内转运相关基因 (6.7%) 和未知功能基因 (20%) 6 大类。分析其中一些重要的基因, 如 RPM1在逆境抗性中起作用, MYM 锌指蛋白、BCAS2 蛋白和 EIF3B翻译起始因子都与调控转录翻译相关。通过 c DNA-AFLP技术筛选了多个半膜覆盖下差异
3、表达的基因, 为揭示半膜覆盖影响玉米生长发育的分子机制提供了基础资料。关键词： 玉米; 栽培方式; 半膜覆盖; cDNA-AFLP; 差异表达; 作者简介：高海荣 (1991) , 男, 硕士研究生;研究方向:作物栽培生理。作者简介：王玉芬, E-mail:。基金：内蒙古科技计划项目 (No.20140169) Differentially Expressed Genes in Partial Plastic Film-mulched Cultivation of Maize at Bell Stage Based on cDNA-AFLP TechnologyGAO Hairong LI Q
4、ian WANG Yufen GUO Jiufeng MA Mengyu LI Yudong BAI Lanfang College of Life Science, Inner Mongolia University; Key Laboratory of Ion Bioengineering of Inner Mongolia Autonomuos Region, School of Physical Science and Technology, Inner Mongolia University; Abstract： In order to investigate the molecul
5、ar mechanism of the regulation of maize growth under partial plastic film-mulched cultivation, the differentially expressed genes were screened by 90 pairs of single primers using c DNA-AFLP technique, and bioinformatics analysis was carried out with Jundan 29 as the material under openfield-cultiva
6、tion for the control and partial plastic film-mulched. The results showed that a total of 2 298 differential fragments were amplified by the 90 primer pairs, of which 1 429 were up-regulated (45% of the total number of bands) , 869 were down-regulated ( 23.7% of the total number of bands) . 877 gene
7、s were expressed without difference (27.6% of the total number of bands) . Twenty different differential fragments were selected and sequenced. Used Blast database comparison and gene annotation analysis, fitteen fragments could be divided into 6 groups according to the functions, namely cytoskeleto
8、n genes (13.3%) , energy metabolism gens (13.3%) , cell rescue and defense genes ( 6.7%) , transcription genes ( 40%) , intracellular transport related genes ( 6.7%) and unknown function (20%) . Some important genes were analyzed. For example, RPM1 protein plays a crucial role in adversity resistanc
9、e, MYM zinc finger protein, BCAS2 protein and EIF3B are related to the regulation of transcription and translation. This study would provide basic data for revealing the molecular mechanism of partial plastic film-mulched affecting maize growth and development.Keyword： Maize; cultivation pattern; pa
10、rtial plastic film-mulched; cDNA-AFLP; differential gene expression; 玉米 (Zea mays L.) 是重要的粮食、经济和饲料作物。和玉米一样, 大多数作物对于干旱敏感, 干旱地区的作物生长发育会受到不同程度的影响。干旱胁迫影响到植物的许多进程, 如细胞壁的延伸受抑, 降低光合速率以及叶绿体对光能的吸收能力, 影响光合碳同化和渗透调节等方面1-3。覆盖地膜栽培在旱作农业方面起到很大的帮助, 尤其是北方地区, 地膜覆盖栽培可以有效的减少地面水分散失, 存储雨水, 增加地表温度和抗虫防病等4-7。因此, 筛选和分离地膜覆盖影响玉
11、米生长的相关基因, 探寻地膜覆盖调控玉米生长的分子机理, 为玉米栽培和育种方面提供有价值的基因资源。半膜覆盖和全膜覆盖已经广泛应用到世界各地, 尤其干旱地区, 带来的经济效益已得到广泛认可。李霞8在研究抗旱栽培模式的技术效益时发现, 半膜覆盖垄沟栽培和全膜双垄沟播前覆膜较不覆膜栽培的增产率分别是 149.56%和223.31%。长时间全垄地膜覆盖会导致植株侧根量减少, 根层变浅, 中后期土壤温度偏高, 植物易早衰等。半膜覆盖的优势有: (1) 作物根系一半处于膜内, 一半处于膜外, 能提高肥料利用率, 促进根系发育和生长; (2) 减少一半地膜使用量, 有效降低“白色污染”9。c DNA-AF
12、LP是 Bachem等10于 1996年提出的一种差异表达鉴定技术, 是结合了 RT-PCR与 AFLP两种技术建立的, 主要用于 RNA指纹图谱分析, 具有可靠性高, 重复性好和不需预知序列信息等优点, 已经被广泛的用于基因差异显示、表达基因遗传连锁作图和基因克隆。Melloul M 等11利用 c DNA-AFLP技术筛选硬粒小麦 (Triticum durum) 在干旱胁迫下差异表达的基因。高凤华等12应用相同技术, 比较干旱胁迫条件下水稻和旱稻转录本表达谱, 结果表明 57个基因在旱稻中特异表达, 38 个在水稻中特异表达, 这些基因可能包括在干旱抗性中起作用的细胞挽救和防御基因, 信
13、号转导分子, 生长发育必需的核苷酸和氨基酸生物合成基因以及生长发育调控基因等。近年来, c DNA-AFLP 技术被广泛应用在作物逆境胁迫的差异基因表达方面, 而对作物不同栽培方式下相关基因的鉴定和发掘方面涉及很少。然而, 目前作物不同栽培方式的研究主要集中在耕作方式、改善土壤理化性状、提高土壤肥力、促进早生快发和提高产量与品质等方面, 而对其生理和分子机制方面的研究还较少。研究不同栽培方式下, 作物基因的差异表达将已经成为目前的研究热点。本实验以玉米露地种植为对照 (CK) , 同时将半膜覆盖间隔种植, 在大喇叭口时期取样, 利用 c DNA-AFLP技术分离筛选差异表达的基因, 揭示基因表
14、达谱的变化情况, 旨在分子水平上了解半膜覆盖调控玉米生长发育的分子机制, 对玉米栽培的生理和分子方面提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料选用玉米品种浚单 29号, 在内蒙古自治区赤峰市松山区试验田进行种植。将半膜覆盖和露地栽培 (CK) 间隔种植, 大喇叭口期分别在玉米顶端叶片取样10株, 无菌水冲洗后用液氮冷冻, 材料置于小液氮罐中带回, 保存在-70冰箱中备用。1.1.2 主要试剂Prime Script Double Strand c DNA Synthsis Kit (6111A) 购自大连 Ta Ka Ra宝生物工程有限公司;DEPC 购自上海 VETEC复申生物
15、科技有限公司;Mse购自美国 NEB公司;Pst购自加拿大 Fermentas公司;T4 DNA Ligase、Dream Taq Green PCR Master Mix (2X) 购自美国 Thermo Scientific公司;接头、预扩增引物及选择性扩增引物均由上海 Invitrogen有限公司合成;其他药品均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 总 RNA的提取及 c DNA的合成取约 400 mg的冷冻玉米叶片材料, 分别在液氮中混样充分研磨后, 按照改良的SDS法提取总 RNA, 测 OD值确定 RNA的浓度, 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。加入一定量的 DNase
16、消化 g DNA;c DNA的合成按照 Prime Script Double Strand c DNA Synthsis Kit使用说明, 分为 c DNA第一条链的合成, 第二条链的合成及 c DNA双链的精制纯化过程。1.2.2 酶切及连接用两种高频限制性内切酶 Mse和 Pst分别对两种样品的 c DNA分别进行双酶切, 反应体系为 dsc DNA (100 ng/L) 5L, Mse1L, Pst1L, 10Fast Digest Buffer 2L, dd H 2O补充至总体积为 20L;反应条件为37反应 20 min, 65灭活 5 min。取 10L 酶切产物, 向其中加入 Mse接头 (5mol/L) 1L, Pst接头 (50mol/L) 2L, T4DNA Ligase (5 U/L) 1L, 10T4 DNA Ligase Buffer 2L, dd H 2O补充至总体积为 20L。反应条件为 22反
