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1、Prdx2 基因表达情况对结直肠癌 SW480细胞影响作用分析 周云 李华 刘芳 王凤云 河北省保定市第一医院老年病科 河北省保定市第一医院肿瘤外科 河北省保定市第一医院病理科 河北省保定市第一医院血液科 摘 要： 目的 探讨硫氧还蛋白过氧化物酶 2 (Prdx2) 基因表达对结直肠癌 SW480 细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法 采用慢病毒空载体 (空白组) 、干扰片段 (Prdx2-shRNA) 慢病毒载体转染结直肠癌 SW480 细胞 (实验组) , 野生型结直肠癌 SW480 细胞作为对照组, 分别于转染后培养 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 采用 MTT 法检测
2、SW480 细胞增殖情况, 采用流式细胞仪技术检测培养120 h 后细胞的凋亡率, 采用实时荧光定量-聚合酶链反应 (qRt-PCR) 及Westernblot 法检测 Prdx2、Survivin mRNA 及蛋白的表达, 采用 Transwell 侵袭实验检测 SW480 细胞的侵袭能力。结果 实验组的 W480 细胞凋亡率显著高于空白组和对照组 (P0.05) , 培养 48 h、72 h、96 h、120 h, 实验组的 W480细胞增殖能力明显低于空白组和对照组 (P0.05) , 实验组的SPrdx2、Survivin mRNA 及蛋白相对表达水平显著低于空白组和对照组 (P0.0
3、5) ;Transwell 侵袭实验结果显示, 实验组的转染结直肠癌 SW480 细胞侵袭能力强于空白组和对照组 (P0.05) 。结论 Prdx2 基因沉默会抑制结直肠癌 SW480 细胞的增殖、促进凋亡, 但是会增强结直肠癌 SW480 细胞的侵袭能力。关键词： 结直肠癌; 硫氧还蛋白过氧化物酶 2; SW480 细胞; 增殖; 侵袭; 凋亡; 作者简介：李华, E-mail:收稿日期：2017-05-18Analysis of the effect of Prdx2 gene expression on SW480 cells in colorectal cancerZHOU Yun L
4、I Hua LIU Fang Department of Geriatrics, The First Hospital, Department of Hematology; Department of Oncology, The First Hospital, Department of Hematology; Department of Pathology, The First Hospital, Department of Hematology; Abstract： Objective To investigate the effect of the expression of Prdx2
5、 gene on the proliferation, invasion and apoptosis of human colorectal cancer SW480 cells. Methods The lentiviral vector ( blank group) , interference fragment ( Prdx2-shRNA) lentiviral vector transfection of colorectal cancer cells SW480 ( experimental group) , wild type colorectal cancer SW480 cel
6、ls as the control group. After transfection respectively 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, MTT method was used to detect the proliferation of SW480 cells, the rate of cell apoptosis after 120 h was detected by culture flow cytometry. Prdx2, Survivin protein and mRNA were detected by real-time quantitat
7、ive polymerase chain reaction ( qRt-PCR) expression and Western-blot method. The SW480 cell invasion ability of invasion were detected by Transwell. Results W480 cell apoptosis in experimental group was significantly higher than that of blank group and control group ( F = 48. 961, P 0. 05) , 48 h, 7
8、2 h, 96 h, 120 h, SW480 cell proliferation in the experimental group were significantly lower than that of the control group and the control group ( P 0. 05) , experimental group SPrdx2, Survivin mRNA and protein expression levels were significantly lower than those of control group and the control
9、group ( P 0. 05) . Transwell invasion assay showed that the experimental group transfected colorectal cancer SW480 cell invasion ability in blank group and control group ( P 0. 05) . Conclusion Prdx2 gene silencing can inhibit the proliferation and promote apoptosis of colorectal cancer SW480 cells,
10、 but it can enhance the invasion ability of SW480 cells in colorectal cancer.Keyword： Colorectal cancer; Prdx2; SW480 cells; Proliferation; Invasion; Apoptosis; Received： 2017-05-18结直肠癌是一种较为常见的消化道恶性肿瘤, 患病率和致死率高, 目前临床上多采用外科手术方式进行治疗, 虽然能取得一定效果, 但会造成患者出血、术后感染等并发症的发生, 严重影响患者的预后1,2。随着分子生物学技术的不断发展, 研究探讨结直
11、肠癌的发生机制并寻求新的治疗靶点也已成为广大医师研究的重点和难点3。结直肠癌的发生多认为是多种基因因素和后天因素共同作用所致, 其中硫氧还蛋白过氧化物酶 (peroxiredoxins, PRDXs) 家族在抑制细胞衰老以及促进肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用4。为此, 本研究采用结直肠癌 SW480 细胞作为研究对象, 探讨分析硫氧还蛋白过氧化物酶 2 (Prdx2) 基因表达对结直肠癌 SW480 细胞增殖、侵袭及凋亡的影响, 旨在为临床上寻求新的治疗靶点提供依据。1 材料与方法1.1 实验细胞、仪器、试剂结直肠癌细胞株 SW480 由中国科学院上海细胞所提供。MTT、二甲基亚砜、嘌呤
12、霉素、L-15 培养基、RPMI-1640 培养基均购自美国 Sigma 公司;兔抗人Prdx2、survivin 单克隆抗体、HRP 标记的山羊抗兔 Ig G 克隆抗体、RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒均购自美国 Epitomics 公司;流式细胞仪检测试剂盒、ECL 试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。离心机购自德国 IKA公司, 培养箱购自德国 Binder 公司, 荧光定量 PCR 仪购自美国应用生物系统公司, 酶标仪购自德国拜发仪器公司, 光学显微镜和荧光显微镜均购自日本奥林巴斯仪器公司。1.2 实验方法将 SW480 细胞置于含 10%胎牛血清的 L-15 培养
13、基中, 在 5%CO2、37条件下进行培养和传代, 每 2 天更换培养液。取传代后细胞接种于 6 孔培养板, 分别以慢病毒空载体 (空白组) 和干扰片段 (Prdx2-shRNA) 慢病毒载体 (实验组) 转染结直肠癌 SW480 细胞, 感染复数 (MOI) 为 50, 并以野生型结直肠癌 SW480细胞作为对照组。转染 24 h 后加入嘌呤霉素 (1.25g/ml) 筛选并建立稳定转染细胞系, 继续培养 120 h, 于荧光显微镜下观察转染效果。1.3 MTT 法分别于培养 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 时取各组细胞悬液加入 MTT (5 mg/ml) 孵育 4 h,
14、 随后加入 DMSO 进行溶解并沉淀, 利用酶标仪在 490 nm 波长测定各孔的吸光值 (A) , 每组实验重复 3 次。细胞增殖抑制率= (对照组平均OD 值-用药组平均 OD 值) /对照组平均 OD 值100%, 实验重复 3 次。1.4 流式细胞仪技术培养 120 h 后取各组细胞悬液以磷酸盐缓冲液 (PBS) 充分洗涤, 加入结合缓冲液 (Binding Buffer) 溶液悬浮细胞, 随后依次加入膜联蛋白 V 异硫氰酸荧光素 (Annexin V-FITC) 和碘化丙啶 (Propidium Iodide) , 混匀后室温避光反应 15 min, 最后以流式细胞仪 (FACSCa
15、libur, BD 公司) 进行检测。1.5 RT-PCR 法将各组细胞悬液以 RNA 提取试剂盒提取总 RNA, 加入逆转录试剂盒进行逆转录, 随后利用 RT-PCR 试剂盒和荧光定量 PCR 仪定量检测 SPrdx2、Survivin mRNA 的表达情况, 具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。1.6 Western-blot 法将各组细胞抽提蛋白后取约 50g 于聚丙烯胺凝胶中进行电泳, 2 h 后转移至聚亚乙烯双氧化物膜上, 5%脱脂奶粉孵育过夜。先加入 11 000 稀释的兔抗人Prdx2、Survivin、-actin 单克隆抗体于 4条件下孵育过夜, 再加入 15 000 的山
16、羊抗兔 HRP 二抗于 37孵育 1 h, 加入化学发光试剂 (ECL) 后凝胶成像仪显影并拍照, 利用软件计算 Prdx2、survivin 蛋白相对表达量。1.7 Transwell 侵袭实验先以无血清培养基在 37条件润湿 Transwel 小室 2 h。将转染 120 h 的细胞用胰酶消化后计数, 选取 110 个细胞以无血清的 RPMI-1640 培养液进行重悬并接种于上室, 下室中仅加入 10%的完全培养基, 于 37、5%CO 2条件下培养 48 h。取出滤膜后以 10%多聚甲醛固定, 苏木素伊红染色后光镜下观察, 计数穿膜细胞数, 取其均值代表迁移力量值。1.8 统计学处理数据统计分析采用 SPSS 16.0 进行处理, 各计量指标采用均数标准差 (s) 进行统计描述, 三组间比较采用单因素方差分析法, 两组间比较采用 t 检验。P 值0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 转染结直肠癌 SW480 细胞情况观察
