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1、RUNX2 在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA 对 Hela229 细胞 RUNX2 表达及细胞增殖与凋亡的影响 张威 郭文涛 曾宪旭 班振英 郑州大学第三附属医院病理科 广东医科大学基础医学院病原生物实验室 摘 要： 目的:探讨 RUNX2 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及 RUNX2 siRNA 对宫颈鳞癌Hela229 细胞 RUNX2 基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测 50 例宫颈鳞癌、30 例宫颈高级别鳞状上皮内病变 (HSIL) 及 30 例正常宫颈黏膜组织中 RUNX2 蛋白的表达情况, 并分析宫颈鳞癌组织中 RUNX2 蛋白表达与临床病理特征的关系。
2、设计合成 RUNX2 siRNA, 通过脂质体将其转染至Hela229 细胞, 同时设立空白对照 (不转染) 和阴性对照 (转染非特异性 siRNA) 细胞组。转染 24、48、72 h 后, 采用 MTT 法检测各组细胞增殖, 计算增殖抑制率;转染 72 h 后, 采用 RT-PCR 及 Western blot 技术检测细胞中 RUNX2 mRNA 及蛋白的表达, 采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:宫颈鳞癌组织中 RUNX2 阳性表达率高于 HSIL 及正常宫颈组织 (P75%记为 4 分;依据细胞染色程度评分:无染色为 0 分, 浅黄色为 1 分, 黄色为 2 分, 棕黄色为 3 分。两
3、项评分的乘积为总分, 总分3 分判定为阳性表达。1.3 Hela229 细胞分组Hela299 细胞经传代培养, 当细胞铺满大部分培养瓶底时 (约 80%90%) 分 3 组培养。 (1) 空白对照组:将细胞常规培养于含体积分数 10%胎牛血清的 DMEM 培养液中, 37、体积分数 5%CO2孵箱中培养, 不进行转染操作。 (2) RUNX2 siRNA 组:根据 Gen Bank 中 RUNX2 c DNA 序列, 遵循 siRNA 设计原则, 参考文献8设计合成 RUNX2 siRNA。反义序列:5-AATGGCAGCACGC TATTAAATCCTGTCTC-3;正义序列:5-AAAT
4、TTA ATAGCGTGCTGCCACCTGTCTC-3。RUNX2 siRNA 由上海生工生物工程有限公司合成。取对数生长期的 Hela229细胞, 消化后接种于 6 孔板中, 参考转染试剂盒 Lipofectamine2000 (美国Invitrogen 公司) 说明书将 RUNX2 siRNA (80 nmol/L) 转染到 Hela229 细胞中。转染后于体积分数 5%CO2、37恒温培养箱中培养 5 h, 更换含体积分数 10%胎牛血清的培养基继续培养。 (3) 阴性对照组:细胞按 RUNX2 siRNA 组处理, 但不转染 RUNX2 siRNA, 而转染非特异性的 siRNA。1
5、.4 MTT 法检测 Hela299 细胞增殖抑制率收集对数生长期的 Hela229 细胞, 消化后制备成单细胞悬液, 经细胞计数后按5 000 个/孔接种在 96 孔板上, 按 1.3 分组处理, 分别培养 24、48、72 h 后, 每孔加 20L 的 MTT (5 g/L, 美国 Sigma 公司) 继续培养 4 h, 弃去上清, 加入 200L DMSO, 摇床上低速振荡 10 min 显色。用酶标仪检测各孔 492 nm 处的光密度 (OD) 值, 每组设 3 个复孔, 取平均值。细胞增殖抑制率= (1-实验孔OD 值/对照孔 OD 值) 100%。1.5 流式细胞术检测 Hela2
6、99 细胞凋亡细胞分组培养 72 h 后收集细胞, 制备细胞悬液。取 110 个细胞, 离心弃上清, 重悬细胞后按照 Annexin V-FITC 和 PI 双染试剂盒说明书操作检测细胞凋亡, 以 PI、Annexin V-FITC 单染细胞作为基准参照。用 Cell Quest 软件进行结果分析, 计算细胞凋亡率。1.6 RT-PCR 法检测 Hela299 细胞中 RUNX2mRNA 的表达细胞分组培养 72 h 后, 用 Trizol 试剂 (MRC 公司) 提取细胞总 RNA, 用 M-MLV酶行逆转录后, 进行 PCR。RUNX2 引物序列为 5-GCAGT TCCCAAGCATTT
7、CAT-3和5-GAAGGGTCCACTCT GGCTTT-3, 产物长度 190 bp。内参 GAPDH 引物序列为 5-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3和 5-GACG GACACATTGGGGGTAG-3, 产物长度 419 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成, RT-PCR 试剂盒购于大连宝生物公司。PCR 反应条件:95预变性 2min;95变性 30 s, 55退火 45 s, 72延伸45 s, 30 个循环;最后 72延伸 5 min。15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 用 Gel-Doc2000 型凝胶成像分析系统检测条带灰度值, 以目的条带和
8、内参条带灰度值的比值表示目的 mRNA 的相对表达量。1.7 Western blot 法检测 Hela299 细胞中 RUNX2 蛋白的表达分组培养 72 h 后收集细胞, 用含有 PMSF 的细胞裂解液将细胞裂解, 收集蛋白, BAC 法定量。用 100 g/L 分离胶、50 g/L 浓缩胶进行蛋白电泳, 将蛋白转移到NC 膜上, 用 50 g/L 脱脂奶粉封闭 2 h, 加一抗 (稀释度 1500) 4孵育过夜, 加 HRP 标记的二抗室温杂交 1 h, 洗转印膜 3 次后, 采用 ECL Advance 试剂盒 (美国通用公司) 显色, 然后显影、定影、照相, 采用 Quantity
9、One 软件分析各蛋白条带灰度值, 表示蛋白表达水平。1.8 统计学处理采用 SPSS 21.0 进行统计分析, 不同宫颈组织中、不同临床病理特征宫颈鳞癌组织中 RUNX2 蛋白阳性表达率的比较采用 检验或精确概率法, 3 组细胞各指标的比较采用单因素方差分析。检验水准 =0.05。2 结果2.1 宫颈组织中 RUNX2 蛋白的表达见图 1。正常宫颈、HSIL 和宫颈鳞癌组织中 RUNX2 阳性表达率分别为 14%、44%和 72%;3 组 RUNX2 阳性表达率差异有统计学意义 (=34.262, P0.001) , 宫颈鳞癌组织中 RUNX2 阳性表达率明显高于正常宫颈和 HSIL 组织
10、(P0.016) 。图 1 各种宫颈组织中 RUNX2 蛋白的表达 (SP, 200) 下载原图A:正常宫颈组织;B:HSIL 组织;C:宫颈鳞癌组织。2.2 不同临床病理特征宫颈鳞癌组织中 RUNX2 表达的比较见表 1。表 1 不同临床病理特征宫颈鳞癌组织中 RUNX2 表达比较 下载原表 2.3 RUNX2 siRNA 对 Hela229 细胞增殖的影响见表 2。RUNX2 siRNA 组 48、72 h 细胞增殖抑制率均低于空白对照组及阴性对照组 (P0.001) , 且细胞增殖抑制率随着培养时间的延长而增加。表 2 3 组细胞增殖抑制率的比较 (n=3) 下载原表 2.4 RUNX2
11、 siRNA 对 Hela229 细胞凋亡的影响RUNX2 siRNA 组细胞凋亡率为 (15.960.73) %, 与空白对照组 (6.750.70) %和阴性对照组 (6.460.65) %相比, 显著升高 (F=181.770, P0.001) 。2.5 RUNX2 siRNA 对 Hela229 细胞 RUNX2 mR-NA 及蛋白表达的影响见图 2、图 3 及表 3。RUNX2 siRNA 组 RUNX2 mRNA 相对表达量和 RUNX2 蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组明显降低。图 2 RT-PCR 法检测 RUNX2 mRNA 的表达 下载原图M:Marker;1:RUNX
12、2 siRNA 组;2:空白对照组;3:阴性对照组。图 3 Western blot 法检测 RNUX2 蛋白的表达 下载原图1:空白对照组;2:阴性对照组;3:RUNX2 siRNA 组。表 3 3 组细胞 RUNX2 mRNA 和蛋白表达的比较 下载原表 3 讨论RUNXs 家族成员包括 RUNX1、RUNX2 及 RUNX3, 研究9-10发现, RUNX1 表达异常与白血病的发生相关, 而 RUNX3 却具有抑制肿瘤生长的作用。所以, RUNX 家族成员在不同组织器官中的功能可能不同。大量的研究证明 RUNX2 与肿瘤的发生发展关系密切。Pratap 等11研究发现过表达 RUNX2
13、的转基因小鼠 T 细胞正常分化受阻, 从而导致淋巴瘤的发生;Westendorf 等12的研究结果显示 RUNX2可通过抑制 p21 (CIP1/WAF1) 促进血管内皮细胞的分裂和增殖, 从而促进血管的形成;Won 等6发现抑制骨肉瘤细胞 RUNX2 的表达, G 1/G0期细胞增加, 细胞体外生存能力显著降低。目前, 关于 RUNX2 与宫颈癌关系的研究鲜有报道。该研究应用免疫组化技术检测了 RUNX2 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况, 结果显示 RUNX2 蛋白在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率高于正常宫颈黏膜组织;且癌组织临床分期越高, 其阳性表达率越高。另外, RUNX2 在宫颈 HSIL
14、 组织中也高表达, 但低于宫颈鳞癌组织。可见, RUNX2 蛋白高表达与宫颈鳞癌的发生发展密切相关, 有可能成为宫颈鳞癌早期诊断的指标。RNAi 技术是采用特定双链 RNA (dsRNA) 引起序列特异性的转录后基因沉默, 它可以高效、特异性的抑制目的基因的表达。作者设计合成了靶向 RUNX2 的siRNA, 并将其转染宫颈鳞癌 Hela229 细胞, 检测细胞 RUNX2 表达、细胞增殖及凋亡情况, 发现 RUNX2 siRNA 可抑制 Hela229 细胞 RUNX2mRNA 及蛋白的表达, 而且转染 RUNX2 siRNA 的 Hela229 细胞增殖受抑, 细胞凋亡增加。这一结果进一步
15、证明 RUNX2 与宫颈鳞癌细胞的增殖关系密切。综上所述, RUNX2 有望成为宫颈鳞癌治疗的新靶点, 而 RUNX2 siRNA 对于宫颈鳞癌的治疗值得进一步研究。参考文献1FRANCESCHI RT, XIAOG.Regulation of the osteoblastspecific transcription factor, Runx2:responsiveness to multiple signal transduction pathwaysJ.J Cell Biochem, 2003, 88 (3) :446 2ENOMOTO H, FURUICHI T, ZANMA A, et
16、 al.Runx2 deficiency in chondrocytes causes adipogenic changes in vitroJ.J Cell Sci, 2004, 117 (Pt 3) :417 3CHEN H, GHORI-JAVED FY, RASHID H, et al.Runx2regulates endochondral ossification through control of chondrocyte proliferation and differentiationJ.J Bone Miner Res, 2014, 29 (12) :2653 4CHIMGE NO, BANIWAL SK, LITTLE GH, et al.Regulation of breast cancer metastasis by Run
