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1、逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧 作者：51atgc 点击： 1488 次 一、逆 转 录 病 毒 概 述反转录病毒是 RNA 病毒，但有反转录酶，可使 RNA 转录为 DNA，再整合到宿主细胞基因组。 逆 转 录 病 毒 即 RNA 病 毒 ， 需 在 逆 转 录 酶 的 作 用 下 首 先 将RNA 转 变 为 cDNA， 再 在 DNA 复 制 、 转 录 、 翻 译 等 蛋 白 酶 作 用 下 扩 增 的一 类 病 毒 。 逆 转 录 病 毒 是 RNA 病 毒 ， 它 有 三 个 基 因 ： gag-编 码 病 毒 的 核 心蛋 白 ；
2、pol-编 码 逆 转 录 酶 ； env-编 码 病 毒 的 被 膜 糖 蛋 白 。二 、 逆 转 录 病 毒 的 许 多 特 点便于其发展成为动物基因克隆载体。就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能
3、力。逆 转 录 病 毒 载 体 最 大 优 点 是(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，达到 100 %(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三 、 逆 转 录 病 毒 载 体 的 包 装 原 理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完
4、成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。四 、逆转录病毒包装程序1、接种 293 细胞2、磷酸钙转染：编码逆转录病毒载体、逆转录病毒结构基因质粒（是病毒颗粒形成、复制所必需的病毒结构蛋白基因）共导入 293 细胞磷酸钙转染原理：磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙DNA 复合物的一种将 DNA 导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合
5、。磷酸钙DNA 复合物黏附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的 DNA 可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上，从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。3、接种靶细胞4、收病毒上清感染靶细胞/保存【方法与步骤】 （一）将逆转录病毒载体导入 293 细胞 1在转染前 24 h，在铺有 4ml 的 293 生长培养基的 60mm 培养皿中接种包装细胞 293 细胞，接种密度大约 2.5x106。 2转染前移去培养基，并加入新鲜的培养基。 3在双蒸水中加入 610g 质粒 DNA，形成鸡尾酒感染混合液，终体积为438l。再加入 62l 的 2m
6、ol/L CaCl2溶液。 4加入 500l 的 2 HBS(pH7.05)，晃动管子或用移液管吹打均匀，立即将溶液加到细胞上，并轻旋平皿使混合均匀。然后，将细胞放回培养箱中培养。 5转染 36 h 后，移去培养基，并温和地加入 3ml 新鲜的 293 培养基。 6大约在转染 48 h 后，收获逆转录病毒上清。轻轻地移出上清，用 0.45m的滤膜过滤，或在 4以 500g 离心 5min 以除去活细胞。 7如果在 12 h 内使用逆转录病毒上清，将其放置在冰上。若时间间隔较长时，置于干冰上冰冻，而后转到-70贮存。 8融化冰冻的上清，在 37下加温片刻，立即使用。 （二）用逆转录病毒上清感染 NIH-3T3 细胞 1在感染前 1218h，将 5x105的 NIH-3T3 细胞铺于 100mm 的平皿中。 2准备 3ml 的包含逆转录病毒上清、4g/ml 的 polybrene，和成纤维细胞培养基的感染混合剂。 3从铺有 NIH-3T3 细胞的平皿上移去培养基，并加上感染混合剂。 4将平皿放回培养箱中培养至少 3 h。 5向平皿上加入 7ml 成纤维细胞培养基。 6转导细胞在感染后 3648 h 可以进行检测。
