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1、陕西理工学院毕业设计第 1 页 共 7 页富铁酵母的资源化利用薛强（陕理工化学与环境科学学院院（系）环境工程专业 1101 班级，陕西 汉中 723000）指导教师：李琛摘要 铁是生物有机体必需的矿物质营养元素。综述了富铁酵母的研究 进展、吸 铁转运机制及应用前景。关键词富铁酵母;研究进展;铁转运机制;应用Resource Utilization of Iron-Rich YeastXUE Qiang（Grade11, Class01, Major Environmental Engineering, Chmistry and Environmental Dept.，Shaanxi Unive
2、rsity of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi）Tutor:Le ChenAbstract: Iron is an essential nutrient for nearly all organisms, Research progress, the mechanism of iron-trans-portation, and the prospect of iron-rich yeast were reviewed in this paper.Key words: iron-rich yeast; research progress; mechanis
3、m of iron-transportation; application引 言铁是人和动物维持生命和发育的必需营养物质。铁的缺乏会引起人及动物缺铁性贫血及一些其他临床症状。微量元素铁一般以无机盐形态补充,这种形式不利于人及动物吸收利用。利用生物转化法,将无机状态的铁转化成有机状态的铁,可以提高生物体对铁的利用率,是开发新型铁源,提高铁的利用率的主要措施。近十几年来,用微生物、特别是用酵母菌为载体富集人及动物所必需的微量元陕西理工学院毕业设计第 2 页 共 7 页素以求有机形态,制造成本较低廉而富有多种营养的微量元素产品已引起人们的关注。用酵母富集微量元素铁的研究也已成热点课题。已有实验表明1
4、,2,富铁酵母具有较高的生物利用率。本文综述了富铁酵母的资源化利用。1 酵母富集铁的研究概况1.1 富铁酵母的选育目前,国内外多采用食品级微生物)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Sac-charomyces uvarum)作为富集微量元素铁的载体。惟在富铁酵母选育及发酵条件优化方面的研究报道较少。王伟利等人3采用富集培养方法,从 22 株酵母菌中筛选出 1 株能够富集高含量铁的菌株,并对其生长条件、铁盐的筛选和添加浓度进行了研究。研究表明,酵母富集的适宜铁盐为硫酸亚铁,其添加的离子浓度为 60120 mg/kg,最适生长温度和 pH 分别为 28e 和
5、 5.5。在上述优化条件下,酵母细胞富集铁能力最强,铁含量达 8 mg/g。中科院微生物所酵母菌分子遗传与育种研究组,采用杂交和原生质体融合技术选育到生物量高、富铁能力强的优良富铁酵母,铁含量高达 24.5 mg/g4。石长波、张培茵等人5,6的研究表明,酵母细胞内铁含量随着培养基中铁盐浓度的增加而有明显的增加,而酵母得率则呈下降趋势,说明铁盐浓度是影响酵母中铁富集量及酵母生长的重要因素。1.2 铁在酵母细胞中的分布及存在形式Gaudreau 等人7的研究表明,在酵母细胞中,铁主要定位于细胞壁,细胞壁中的铁含量约为细胞质中铁含量的 3 倍。细胞质中的铁主要分布在线粒体、液泡和胞质溶胶。Schi
6、lke 等人8的研究表明,在线粒体内膜上,进行氧化还原反应的许多电子转运蛋白,如 Fe-S 簇和血红素等均在其活性位点含有铁。Liangtao Li 等人9的研究表明大多数利用铁的酶定位于胞质溶胶中。另外,下列 3 条证据支持液泡是铁储存的细胞器的观点:液泡突变株表现出增强对金属的敏感性10,11; 从液泡中能分离到铁12;转运系统具有从液泡中吸取铁的能力13。Raguzzi 等人12认为,酵母细胞对铁的储藏有 2 种形式,一种是以类似铁蛋白的胞质分子的形式储藏,另外一种是铁与多磷酸盐形成结合物储藏在液泡内。酵母铁蛋白的分子量约为 274 ku。酵母铁蛋白的铁含量较低,每个分子结合50100
7、个铁原子,与胞内的铁浓度无关。而液泡内铁的浓度主要与细胞所处的环境有关。1.3 酵母细胞中铁的转运机制1.3.1 高亲和力与低亲和力铁转运系统 酵母细胞的吸铁机制与原核生物的吸铁机制不同,它不能分泌铁载体来完成对外界环境中铁营养元素的吸收和利用。为了适应较宽范围对铁的需求,既不缺铁又不造成铁中毒,酵母细胞进化出 2 种铁转运系统来识别二价铁,一种为低亲和力系统,一种为高亲和力系统。酵母细胞积累外界环境中的铁元素必须通过 2 个步骤来完成:首先由位于细胞质膜上的 Fe3+还原酶将 Fe3+还原成为能被细胞直陕西理工学院毕业设计第 3 页 共 7 页接吸收的 Fe2+形式14;然后由低亲和力和高亲
8、和力的转移吸收系统将 Fe2+转运到细胞质内15。研究表明,低亲和力系统与高亲和力系统是彼此分开互不干扰的15。高亲和力的转移吸收系统与铜的转运有关16。1.3.2 CCC1 转运系统 在酵母中,铁的吸收涉及不同的转运系统。铁跨膜转运机制的研究已取得很大进展。然而,较少知道细胞内铁的运输和储藏。Liangtao Li 等人9的研究表明 CCC1 是一种铁/锰离子转运系统,影响铁和锰离子在液泡内积累,涉及铁从胞质溶胶转移到液泡内。CCC1 的过量表达致使胞质溶胶的铁含量减少,而使液泡内的铁含量增加。相反,CCC1 的缺失会导致液泡内铁含量和铁储藏量的降低,从而影响胞质溶胶的铁的水平和细胞生长。1
9、.4 酵母细胞富集铁的分子生物学研究铁缺乏和铁过量都可改变生物生理状态而引起营养失调疾病。同时,生物有机体具有各种信号调节机制参与细胞的铁转运与铁储备。简单的单细胞真核生物酵母是研究铁转运机制的理想模式生物。近年来,在酵母铁素营养分子生物学方面的研究有了较大进展。人们利用各种特异的酵母突变株和有效的筛选技术,已克隆到一些与铁转运有关的基因,如能编码将 Fe3+还原成为 Fe2+的 2 种质膜还原酶的 FRE1 基因和 FRE2 基因15,17;酵母质膜上的 Fe2+转运蛋白基因 FTR1 和 FET416,18;参与酵母铁转运系统的铜转运基因 FET3、CTR1 和 CCC21921;酵母细胞
10、线粒体中与转运铁元素有关的基因 MFT1 和 MFT222等。Stearman 等人18的研究表明,FTR1 基因编码质膜上的一种透性酶,与FET3 一起组成酵母细胞的 Fe2+高亲和力系统,完成对 Fe2+的跨膜运输。Dix 等人16的研究表明,酵母细胞的 Fe2+低亲和力系统由 FET4 编码,此低亲和力系统依赖时间、温度及 Fe2+的浓度,而且对Fe2+具有极强的专一性。Liangtao Li 等人22的实验表明,mft1 和 mft2 这两个蛋白具有影响细胞质中铁元素水平的能力,线粒体可能是细胞内部铁元素的储存场所。当细胞处于缺铁胁迫时,线粒体中的铁可能会重新释放到细胞质中再被利用。另
11、外,Yamaguchi 等人23的实验表明,酵母在缺铁条件下吸铁机制中多数基因需要 AFT1 蛋白的转录调控。2 选育富铁酵母材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株402 株不同种属的酵母菌,统一编号为 ZY-1ZY-402,标准交配型菌株 ZF-5-8 (MATA)和 ZW-21(MATA),均由中科院微生物研究所酵母菌分子遗传与育种研究组提供。2.1.2 培养基2.1.2.1 菌种选育培养基陕西理工学院毕业设计第 4 页 共 7 页YEPD 培养基,McClary 生孢培养基,YNB 培养基,YNBS 培养基及 YNB 选择培养基24。2.1.2.2 种子培养基14bBx 麦芽汁。2.1.
12、2.3 摇瓶发酵培养基(gPL)YPD 培养基:葡萄糖 40,蛋白胨 10,酵母粉 10,pH6.0;YPS 培养基:酵母粉 10,蛋白胨 10,蔗糖 40, pH 6.0;YPM 培养基:酵母粉 10,蛋白胨 10,麦芽糖 40, pH 6.0;麦芽汁培养基(Wort):糖浓度为4bBx,pH 6.0;糖蜜培养基 (Molasses):蔗糖糖蜜(含)29)48%蔗糖)41,硫酸铵 0.5,磷酸 1, pH 6.0;Fe2+浓度为 400LgPmL。优化发酵培养基 :葡萄糖 80,蛋白胨 5,酵母粉 10, pH 7.0,Fe2+浓度为600LgPmL。2.1.3 主要试剂硫酸亚铁与分析用试剂
13、均为分析纯。2.2 方法2.2.1 培养方法2.2.1.1 种子培养从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基中,30e、200 rPmin 培养 16 h。2.2.1.2 细胞培养种子培养好后以 10%的接种量接入含有硫酸亚铁的发酵培养基中,30e、200 rPmin 培养。其它培养条件由具体实验确定。2.2.2 菌种的选育方法2.2.2.1 初筛将待筛选的酵母菌细胞分别悬浮于 1 mL 无菌水中。取细胞悬浮液接种至含有不同浓度硫酸亚铁的 YEPD 平板上,28e 培养 3 d。挑出能够在含有较高浓度的硫酸亚铁平板上生长的菌株。2.2.2.2 复筛将初筛菌株接入种子培养基中,28e 振荡培养 1
14、6 h。以 10%的接种量接入含有 400LgPmL Fe2+浓度的 YPD 培养基中,28e 振荡培养 24 h。收集菌体测定生物量和铁含量。2.2.2.3 生孢培养、单倍体分离25、硫酸二乙酯(DES)诱变26及原生质体融合24。2.2.3 分析方法2.2.3.1 菌体干重(生物量)的测定取一定体积发酵液 5000 rPmin 离心 5 min,收集菌体,用蒸馏水洗涤三次,置于干燥箱中 6080e烘干至恒重,称量。由此可得每升培养液的菌体干重。陕西理工学院毕业设计第 5 页 共 7 页2.2.3.2 细胞铁含量的测定采用邻二氮菲比色法测定27。细胞总铁含量(mg FePL) =细胞生物量(
15、gPL)细胞铁含量(mgFePg菌体干重)3 富铁酵母的应用前景缺铁性贫血是遍及全球的营养缺乏症,特别是发展中国家尤为普遍,富铁酵母的食用将减少人类铁缺乏症的困扰,起到一定的预防疾病的作用。富铁酵母具有稳定性好,吸收率高、抗干扰、与食品中其他成分协同配合性好,并具有良好风味等优点。随着对富铁酵母基础和应用的研究,其应用前景会更广泛。参考文献:1 翁聪颖,刘启沛,徐达道.高铁食用酵母铁资源生物利用率评价.、大鼠预防性评价J.营养学报,1989,11(2):311-317.2 刘启沛,翁聪颖,徐达道.高铁食用酵母铁资源生物利用率评价.、婴幼儿喂养试验J.营养学报,1990,12(2):172-17
16、7.3 王伟利,钱爱东,林艳春,等.酵母富集微量元素铁的研究J.中国微生态学杂志,2002,14(2):83 -84.4 袁玉兰,郭雪娜,张博润,等.高生物量富铁酵母菌的选育及其发酵条件的研究J.工业微生物,2004,34(4):29-33.5 张培茵,阎喜霜,姜淑梅,等.铁、锌对啤酒酵母生物特性的影响研究J.食品工业科技,1996,93(1):12 -15.6 石长波,阎喜霜,姜淑梅,等.高铁食用酵母的研究J.食品与发酵工业,1996,12(1):39 -40.7 Gaudreau H,Tompkins TA,Champagne CP.The distributionof iron in iron-enriched cells ofSaccharomyces cerevisiaeJ.Acta Alimentaria,2001,30
