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1、重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则20070914一、前言对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成与预期生物活性相同的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和 DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及
2、病毒和/或致瘤性成分的去除 /灭活工艺的验证。（一）目的和意义经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。（二）适用范围本技术评价一般原则适用于
3、生产治疗用重组制品的哺乳动物细胞，不包括细菌、酵母等重组工程菌，也不包括治疗用体细胞、疫苗生产用细胞基质、杂交瘤细胞等。相关内容可参见国家局已颁布的指导原则和药品审评中心公布的药品技术评价一般原则，重组制品生产用哺乳动物细胞亦须符合这些已有文件的相关要求。（三）局限性本技术评价一般原则主要结合目前对于重组工程细胞结构、功能，细胞致瘤性和内源性病毒对重组产品带来的风险及微生物污染因子的危害性共识，提出技术审评关注的重点问题和基本原则，需要结合具体细胞和实际培养控制条件考虑和选择。二、宿主细胞的选择应选择来源、背景十分清楚的适宜宿主细胞，明确存在的内源性病毒和/或致瘤性等影响制品安全性的因素，并结
4、合制品纯化的程度、细胞培养和生产过程中风险性成分的去除/灭活能力及残留量控制水平，以及临床应用适应症和用法用量等特点综合分析，经利弊权衡后确定与特定制品相适应的宿主细胞。应首先选择致瘤性试验阴性和低增殖代次水平的宿主细胞。对于全新构建的转化细胞、从未使用过的改良传代细胞，甚至肿瘤细胞等，由于前期研究、背景资料和致瘤性风险等积累的认识十分有限，其开发应用将引入新的安全性隐患，需要慎重权衡利弊，在开展充分研究的基础上严格控制潜在的风险性。（一）宿主细胞来源、传代保存经过和一般特性用于构建重组工程细胞的宿主细胞其来源和传代保存过程应清楚，可溯源有关背景资料，例如最初分离建立株/系的机构，在不同机构内
5、引进和传代经过，既往进行过的检测分析项目和确证研究结果，细胞保存状态，经体外传代培养已达到的增殖代次/水平及传代过程中所用过的人源或动物源性材料等。传代保存过程中细胞应保持原有特征，没有发生变异和污染。优先选用最初建立的细胞系或由其传代保存的低代次细胞。1、宿主细胞来源和传代保存经过应提供宿主细胞来源的相关资料和证明性文件，说明是否曾进行过遗传操作引入了外源2基因序列，描述已进行过的研究检定项目例如细胞鉴定、内源和外源性因子检测等的结果及引进时进行的复核检定结果。 2、宿主细胞一般特性需阐述宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长一般特征、培养条件和培养液要求。新构建的细胞系应检测致瘤性特征。三
6、、重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定目前可采用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法和筛选标记等进行工程细胞的构建和筛选，构建成功的标志是工程细胞能够稳定、高效地表达结构正确且具有生物活性的目的产物。应尽可能提供关于重组工程细胞构建和鉴定的详细资料并重点描述：（一）目的基因来源应包括最初获得目的基因序列的来源和背景方面的资料，用于制备目的基因 cDNA 的方法，以及必要的初步序列分析。 （二）表达载体的具体构建步骤需说明表达载体组成成分以及主要元件的来源和功能，包括插入基因和侧翼区序列、复制子、启动子、增强子、抗性标记以及主要的酶切位点等。应详述表达载体构建或改建的过程。对构建成功的表达载体应
7、进行必要的鉴定，并提供相关试验资料如构建中所用位点的酶切图谱等。（三）载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选应详细说明载体引入宿主细胞的方法和操作过程，重组工程细胞的筛选原理、条件和标准，以及采用何种方法增加基因拷贝数等。阐述外源基因引入宿主细胞后产生的变化，符合筛选标准的候选细胞可能为多个细胞株，但拟用于建库的细胞株应为经研究比较后确定的单一细胞克隆。（四）重组工程细胞的初步鉴定应检测重组后细胞基本性状的改变，比较研究插入外源基因后细胞致瘤性特征的改变。应说明表达载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体）并采用适宜的方法测定其拷贝数。说明启动和控制目的基因在宿主细胞中表达所采用的方法，并
8、进行初步的表达产物鉴别和表达水平检测。对于选定的工程细胞株应进行充分的目的基因全序列确认，以保证用于编码和表达目的产物的基因在初始核酸序列上的正确性。四、重组工程细胞库的建立连续传代细胞生产重组制品的最大优点是使每批产品都有一个经过检定的共同起源细胞，因此建立细胞库的目的就是为了保证生产的可持续性和产品质量的稳定。重组制品的生产必须建立在良好的细胞库管理基础上。（一）细胞库建立细胞库可为三级即原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB ）；也可采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊情况下，也可使用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体
9、，必要时须经与实际生产过程采用的无血清培养基和培养条件相一致的适应性培养。 （二）建库细胞的管理在制备 WCB 过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起 WCB 中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，应将所有培养皿中的细胞混合成单批后再分装。在细胞库的建库期间应采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其他类型细胞的交叉污染等）。上述各级种子库的细胞应按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求参见本文细胞库检定）。3对于细胞库建库的具体过程、方法和管理的要求，参见参考文献1。五、细胞库检定正确
10、的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其它细胞，能够直接扩增储备或者应用于生产。对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其它细胞。保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应。（一）细胞鉴定1、细胞种属的鉴定应验明细胞的种属来源，分析细
11、胞的同一性，排除与其它细胞的交叉污染。目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。2、致瘤性试验应检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性特性、强度改变对产品带来的安全性风险。3、目的基因和表达框架分析目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过 PCR 扩增样本 DNA 或用从细胞基质中分离的RNA 制备的 cDNA 来进行 DNA 序列分析
12、；通过限制性内切酶谱和 Southern 杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。为保证产品结构的正确和持续一致，应在重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定、工艺研究过程中的培养终末期及超过终末期一定水平等不同阶段，采集代表性细胞完成必要的基因序列分析（包括目的基因侧翼区域）。4、表达产物检测应检测分析目的产物的表达量和生物活性。活性测定应选择与其治疗机理相对应并能够定量的方法。活性测定方法学研究可贯穿
13、于药品研究的始终，并经相关验证分析。（二）微生物污染检测1、细菌、真菌和支原体检查应对 MCB、WCB 和工艺研究过程中的 EPC（生产终末期细胞）进行一次全面检查，对生产培养过程中的细胞进行定期监测。具体方法见参考文献1。在进行支原体检查时，应注意同时进行直接培养法和指示细胞染色法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。2、病毒因子的检查包括细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒的检查。对细胞进行病毒检查的种类和方法，应根据细胞的种属和组织来源、传代历史和细胞特性选择。2.1、体外试验应将 MCB、WCB 和 EPC 细胞活细胞或细胞裂解产物接种
14、到尽可能多的病毒易感的指示细胞上。 可以根据细胞来源，传代史和细胞培养基的原料使用情况来选择适宜的指示细胞。检测结果应为阴性。具体方法见参考文献1。2.2、体内试验4可通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。一般应对 MCB、 EPC 进行体内试验。具体方法见参考文献12.3、特异性病毒的检定通过抗体产生试验来检测可能存在于 MCB 细胞中的特异性病毒，如啮齿类动物来源的细胞应进行小鼠、仓鼠或大鼠的抗体生成试验。严格控制对于人类有危害的鼠源性病毒。2.4、逆转录病毒的检测逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶(RT) 检测和电镜技术检查。应采用上
15、述方法对 MCB 和 EPC 细胞进行逆转录病毒的检测。2.4.1、感染性试验应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如 XC 空斑试验（XC plaque）、延时 XC 空斑试验、SL灶点分析（SLFocus ）等。试验时应注意设立恰当的阴/阳性对照。2.4.2、逆转录酶检测对于常规条件下检测结果为阴性而又高度怀疑的细胞，为提高检测的敏感性，可考虑将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。2.4.3、透射电镜检查透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒和病毒样颗粒的存在，应比
16、较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不得用于生产。六、细胞稳定性研究应包括库细胞、生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期一定阶段等不同培养时期的细胞。库细胞应重点考察贮存、复苏等操作处理因素的影响和传代过程中的遗传稳定性，在此基础上确定库细胞传代限度；生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期一定阶段的细胞应考察模拟生产工艺和培养条件对细胞生长状况、表达能力等的影响，并确定生产细胞增殖限度和/或连续培养时间；使细胞始终能够持续、稳定地表达重组制品，并将对终产品产生安全性影响的风险因素严格控制在最低限度。（一）贮存条件下的稳定性当储存的细胞复苏后用于生产制品时，应进行细胞存活率和功能活性等与细胞质量密切关联项目的研究测定，以证实复苏
