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1、1中国临床康复 2006 年 6 月 10 日 第 10 卷 第 21 期干细胞研究的理论与实验张绪斌等张绪斌 解放军第二五一医院北京军区骨科研究诊疗中心0 引言20 世纪 90 年代以来，随着细胞生物学技术的发展及体外分离、培养人胚胎干细胞的成功，干细胞经适当诱导分化可发育为不同类型的细胞、组织和器官，成为移植供体的新来源，作为“种子细胞”的干细胞可以通过细胞工程的方法在体外发育为各种特异性的细胞供移植和细胞替代所需，并可作为基因疗法的靶细胞用于治疗和研究。由于干细胞有广泛的应用前景，它已成为近年来医学和生物学领域研究的热点。作者应用计算机检索 Meclline 数据库 1980-01/20
2、01-01 有关文章，对干细胞的概念、调控、特征及应用进行综述。1 干细胞的概念干细胞具有自我复制的能力，在一定条件下，它可以分化成各种功能细胞，根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。传统观点认为，胚胎干细胞具有全能性，能分化为体内所有的组织和器官，而成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成特定的组织细胞。然而，横向分化的发现，使这个观点受到了挑战。那么胚胎干细胞和成体干细胞有什么关联呢?当受精卵分裂发育成囊胚时，分离内细胞团的细胞经体外培养即得到胚胎干细胞。早在 1970 年 Martin Evans 已成功地分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才
3、获得成功。其实，胚胎动物生殖嵴部位的胚芽细胞同样具有自我复制和分化成各种功能细胞的能力，因此也隶属胚胎干细胞。成年动物的组织和器官，比如上皮和造血系统，之所以具有修复和再生的能力，成体干细胞在其中起着关键的作用，在特定条件下，成体干细胞既可对称分裂为 2 个新的子代干细胞或 2 个功能细胞，也可不对称分裂为 1 个子代干细胞和 1 个功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认2为只有造血系统和上皮等组织含有成体干细胞，但最近的研究表明，成体干细胞普遍存在于人体的各种器官，为利用成体干细胞治疗疾病提供了可能。2 干细胞的调控2.1 内源性调控 不对称分裂对干细胞自我复制非常重要，
4、而这一行为是通过干细胞内的一些结构蛋白和多肽因子调控的，比如在果蝇卵巢中，有一种称为收缩体的调节蛋白。收缩体与纺锤体的结合部位决定了干细胞分裂的位置，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中，实现干细胞的自我复制。转录因子对干细胞分化的调节也非常重要，比如，Oct4 是一种哺乳动物胚胎细胞表达的转录因子，在胚胎干细胞的发生中，它通过诱导生长因子的表达和分泌，影响干细胞周围滋养层细胞的成熟，从而调节干细胞的进一步分化，Oct4 缺失突变的胚胎存在发育障碍。此外，端粒体的长度与干细胞的增殖和分化也有重要关系。敲除端粒体基因的小鼠，其造血干细胞的自我复制能力下降；雄性鼠的精细胞发育也受到障
5、碍，因为端粒体的长度影响染色体的功能，因此染色体的功能状态可能决定了干细胞的命运。2.2 外源性调控除内源性调控外，干细胞的分化还受到其周围组织细胞及细胞外基质等外源性因素的影响。2.2.1 分泌因子至少有两类因子在不同组织甚至不同种属中调节干细胞的增殖和分化:转化生长因子和 Wnt(编码一组调节胚胎发育的分泌蛋白质)家族，比如在角膜干细胞的分化中，转化生长因子作用于角膜缘干细胞周围的间质细胞，诱导间质细胞分泌各种细胞因子，包括血小板衍生生长因子和白血病抑制因子等，对角膜缘干细胞的增殖与分化具有调节作用。其他细胞因子，比如胶质细胞衍生的神经营养因子，不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原
6、细胞的再生和分化有决定作用。Wnts 的作用机制是通过阻止一种细胞黏附分子的分解，从而激活转录因子 Tcf/Lef 的表达，促进干细胞的分化。2.2.2 膜蛋白介导的细胞间相互作用 干细胞的调控也可通过细胞与细胞的相互作用而实现，比如，细胞膜表而分子 Notch 通过结合其配体 Delt。或Jagged，从而在干细胞和周围细胞间传递信号，脊椎动物的胚胎及成年组织包3括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch 信号起着非常重要的作用:当Notch 与其配体结合时，干细胞进行增殖；当 Notch 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。2.2.3 细胞外基质对干细胞的调控 整合素家
7、族是介导干细胞与细胞外基质黏附的最主要的受体，它通过直接激活多种生长因子受体，从而为干细胞的增殖提供适当的微环境，细胞外基质通过调节 1 整合素的表达和激活，调节基底膜成分的变化和干细胞微环境中分泌因子的浓度，从而影响干细胞的分布和分化方向。2.3 干细胞可塑性 越来越多的证据表明，成体干细胞被移植入受体中，表现出很强的可塑性。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞，而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999 年 Goodell等分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养 5d 后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系
8、，这种现象被称为干细胞的横向分化。关于横向分化的调控机制目前还不清楚，大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关，可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。3 干细胞的分离纯化和定向诱导最近干细胞的研究有两个重大的技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功。1998 年 Wisconsin 大学的 James Thomson 和 Johns Hopkins 大学的JohnGearhart 分别把人的胚胎干细胞和胚芽细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行共培养，实现了人类胚胎干细胞体外的非分化增殖，而增殖后的细胞还保持着分
9、化为滋养层组织及 3 种胚层组织的能力。这一技术突破为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。另外一个重大突破是成体干细胞的横向分化。1999 年 Goodell等用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞，这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到治疗作用。干细胞研究的长足进展还包括干细胞的分离纯化技术的进步。干细胞表而4有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有 Sca-1，c-kit 和CD34 等。此外，人造血干细胞还表现为 CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20等表面标志皆为阴性。最近发现，CD34-细胞同样具有造血干细胞
10、的特性，因此，CD34 可能并非造血干细胞的标志，它可能和造血干细胞的功能状态有关。其他各种成体干细胞还有各自独特的标记物，这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有 1 整合素的高表达，而 1 整合素可介导干细胞与细胞外基质黏附，从而抑制其分化的发生。另外，干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料 Hoechst33342 和 Rhodamine123 染色，利用这些特性及表面标志，采用荧光激活的细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。由于干细胞的数目很少，要获得足够的细胞，需要在体外对干细胞进行非分化增殖，这需要许多生长因子及与间质细胞的共培养。Brustl
11、e 等在体外成功地培养了鼠的胚胎干细胞。他们首先把分离的胚胎干细胞在含有成纤维细胞生长因子 2 的培养基中培养，随后加入上皮生长因子，最后在成纤维细胞生长因子 2 和血小板衍生生长因子的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，胚胎干细胞可以保持其分化潜能，如停止供给生长因子，胚胎干细胞会分化为寡树突细胞或星状细胞。目前，人类只有胚胎干细胞和 CD34+的造血干细胞在体外得以扩增。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同，在应用前还需依据靶组织类型对培养的干细胞进行定向分化诱导，准确的分化诱导是应用干细胞治疗疾病的基础，这就需要对干细胞发育的基因调控及微环境的影响进行系统地研究。4 干细胞的分类、
12、特征及应用4.1 胚胎干细胞的特征及应用4.1.1 胚胎干细胞的来源及特征 Evans 等 1981 年首次建立了小鼠的胚胎干细胞系，之后国外相继建立了金黄地鼠、大鼠、鸡、兔、猪和猴的胚胎干细胞系。1998 年美国的 Thomson 等和 Gearhart 等分别建立了来源于人的胚胎多能干细胞系。人胚胎干细胞的主要来源于受精卵发育形成的囊胚内细胞团及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞，或者从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞，其特征为:具有多向5分化潜能和受精卵的某些特性，可以分化为胎儿和成人体内各种类型的组织细胞。可在体外培养条件下建立稳定的的
13、细胞系，可长期增殖培养并保持高度未分化状态和发育潜能。将胚胎干细胞与 816 细胞阶段的胚胎共培养后，植入假妊母体子宫，可发育为嵌合体动物，其遗传特性可进入胚系，遗传给下一代。体外胚胎干细胞具有培养细胞的特性，最大特色是可对它进行遗传改造，核转移和冻存而不失去潜能性。由于胚胎干细胞的全能性，所以能为研究机体各系统的发育分化的调控机制及人造组织器官的移植提供了原材料，因而在近期内成为全球范围内生命科学领域研究的焦点。4.1.2 胚胎干细胞的应用前景 胚胎干细胞研究至今已有 10 多年的历史，人们已利用胚胎干细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统，为在细胞和分子水平上研究哺乳动物的发育生物学提供了良
14、好的材料和方法。采用基因芯片等技术，比较胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因，结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能,胚胎干细胞的研究还提供了在新药的药理、药效、毒理及药代等方面新的研究手段，克服了上述实验不能在人体直接进行的困难，提高了药物应用的效果和安全性。胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和过程，如利用胚胎干细胞制造携带相关特定基因的嵌合体动物，可复制出如地中海贫血等疾病模型，以及供人体使用的动物产品,另外，还可以将体细胞核转移到去核的卵母细胞中，利用其发育形成的胚胎干细胞进行治疗性克隆，但
15、由于该领域的研究才刚刚起步，在体外控制干细胞分化方向的技术尚未完全成功。还有迄今为止，触发和调控细胞分化的机制仍不明了，特别是如何保证在扩增干细胞时以获得足够移植使用的细胞数量的同时又能保持细胞的未分化特性?另外，由于胚胎干细胞胚胎源性的特点，在使用过程中有可能导致肿瘤的发生，因此，必须解决其移植安全性的问题。对于这些问题的回答将直接关系到胚胎干细胞的临床应用，如果能找出其基本答案和一两个解决的办法，将使人类关于胚胎干细胞的知识得到突飞猛进的发展，同时为临床的最终应用提供了可能性。4.2 造血干细胞的特征及其应用 造血干细胞是一类组织特异性干细胞，由胚胎期卵黄囊的中胚层细胞演化而来，相继移行至
16、胚胎内的造血器官、肝、脾6以及骨髓，通过不对称有丝分裂，一方面维持自我细胞数的恒定，另一方面不断地产生各系祖细胞以维持机体的正常造血功能。人们利用造血干细胞的这一特性，先后开展了骨髓移植、外周血干细胞移植和脐血移植。在治疗某些恶性肿瘤、白血病、再生障碍性贫血、遗传性疾病及急性重度放射病上取得了显著的疗效。但目前对造血干细胞的认识还不够深入，除了脾结节形成法和体外细胞集落培养外，尚无法从形态学上识别造血干细胞，只能通过其表而标志物进行分离和纯化。以前普遍认为，可用 CD34+/CD38-细胞代表造血干细胞，但现在发现，CD34+细胞中 90%以上是祖细胞，干细胞只是其中很小一部分。而且新近的研究发现，CD34-/Lin-细胞具有长期重建造血的功能，因此，引发了有关原始的造血干细胞是 CD34+还是 CD34-的争议，除了 CD 抗原外，现在还发现血管内皮细胞生长因子受体 2（VEGFR2，又称为 KDR)是一种新的造血干细胞阳性标志物,在恢复重建造血的实验中，CD34+与 CD34+/KD
