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1、第一章 电子显微镜 第一节 概述一、电子显微镜的发展简史1、20 世纪 30 年代，E.Ruska 在电子光学理论发展的基础上发明了世界上第一台投射式电子显微镜（transmission electron microscope，TEM ）放大倍数仅为 12 倍；1935 年电子显微镜基本定型；1939 年德国西门子公司生产了世界上第一批作为商品的投射式电子显微镜，分辨率优于 10nm，放大倍数达到了 10 万倍。自此，投射式电子显微镜的研究重点是改进设计，提高仪器分辨率。2、1935 年法国 knoll 首先提出了扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SE
2、M）的设计思想和工作原理，1942 年剑桥大学 D.M.Mullan 首次制成了世界上第一台反射扫描电子显微镜。1965 年基本定型；70 年代已发展成为性能完善、自动化程度高，功能齐全的一种电子光学仪器。二、电子显微镜与光学显微镜的比较光学显微镜的光学系统一般采用可见光作为光源，玻璃透镜作为成像、放大透镜。其成像过程是：可见光通过空气和玻璃透镜这两种不同的物质界面时，光的运动速度改变，从而改变运动方向使之汇聚一点（焦点） ，然后再发散，这样就可以把物体的细节加以放大成像，使人们观察到物体的显微结构。电子显微镜采用电子束作为照明系统中的光源，电磁透镜作为成像、放大透镜，其基本成像过程是：电子束
3、通过电子磁透镜时，由于电磁场的作用使电子改变其运动方向而聚在一点（焦点） ，然后发散，从而把物体的微细结构放大成像。不过此时所成的像，人眼不能直接观察到，还须通过一个荧光屏才能看到。三、电子显微镜的分类从使用选择的角度考虑，目前电子显微镜可分为三大类：透射电子显微镜、扫描电子显微镜和分析电子显微镜。按系统分类：透射电子显微镜可分为超高压电子显微镜、高压电子显微镜、高分辨电子显微镜、普及型电子显微镜、简易型电子显微镜五类。第二节 透射式电子显微镜一、透射电镜的概念：是以波长极短的电子束作为照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种高分辨率、高放大倍数的电子光学仪器。即用聚得很细的电子束照射在样品上，接受透
4、过样品并带有样品内部信息的电子，经过物镜聚焦放大成像，这种接收电子成像的显微镜称之为透射电镜。二、透射电镜的基本结构透射电镜主要由电子光学系统、真空系统、电子学系统、冷却系统四部分构成。1. 电子光学系统 相当于光镜的光源和反光镜（1） 照明系统 相当于光学显微镜的照明部分，由电子枪和聚光镜组成1）电子枪：由阴极、阳极、栅极组成。阴极：由直径 0.110.15mm 粗的钨丝制成，呈 V 字型，也称灯丝。当通电达一定温度时，即产生热电子发射，形成强的照明电子束。阳极：是一个中间带孔的金属圆盘，位于阴极的对面，它与阴极之间有 10kv120kv 的电位差，这一负高压用以加速由阴极发射的电子束。栅极
5、：位于阴极和阳极之间，它的电位也比阴极低，起着控制电子束发射及改变电子枪中电场分布的作用。2）聚光镜：将电子枪发射的电子束汇聚在样品上，对样品进行照明。普通电镜有一个聚光镜；高分辨率的电镜有两个聚光镜，在第二聚光镜中装有活动光阑(用白金片做成), 上面有直径为 200m 、300m 和 400m 的圆孔，利用光阑孔的大小，可以控制聚光镜的孔径角，即控制照明束的强弱，使样品不致发生过热现象。（2）样品室样品室是放置样品用的，通过特殊的机械装置更换样品。另外，通过连动装置，在真空外可以操纵样品台在 X、Y 轴方向上移动。（3）成像系统：物镜：是电镜中第一个成像的电子透镜，要求有极高的加工精度及稳定
6、性，以保证成像质量。物镜装有消像散器可消除像散，还装有活动光阑可提高反差。物镜是电镜中最关键的部件，电竞的分辨率主要取决于物镜的分辨率。中间镜：是一个可改变放大倍数的弱透镜，主要用于控制总放大倍数。如果一个中间镜不能满足要求时，还可用两个中间镜来控制放大倍数。投影镜：是将中间镜所成的像进一步放大并投影到荧光屏上，以供观察。与物镜和中间镜比较，投影镜的电流一般是不变的，即其放大倍数是固定的。中间镜和投影镜的数目根据最高分辨率所要求的有效放大倍数而定（总放大倍数为各透镜放大倍数的乘积） 。对它们的要求是：在尽可能缩短镜筒高度的条件下，满足高分辨率所需要的有效放大倍数；像差减到最小，保证图像不失真；
7、可以进行衍射分析等。 （4）观察记录系统 包括荧光屏、光学显微镜和照相机构三部分。荧光屏：是由电子束照射后能转换成光讯号的荧光粉涂制而成，主要作用是呈现透射电子显微像，使用者可以通过荧光屏选择图像区域，在照相前对图像进行聚焦。光学显微镜：安装在主观察窗前，通常选用 510 倍饿双筒显微镜，作用是在不提高电子光学放大倍数的情况下分析高倍的电子图像，保证了在相应的倍数下，不损失图像信息，不降低图像亮度。有助于精确聚焦。照相装置：由暗盒（底片盒、接收盒） 、底片传送机构、快门和自动控制电路等组成。底片感光度、曝光时间确定后，快慢动作，底片传送，各数字的显示等全部自动化控制，使用的高压值、放大倍数、底
8、片序号等全部记录在底片上。2. 真空系统：真空系统由机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门及检测系统组成。作用是排除镜筒中的空气，使镜筒达到高真空状态。否则，电子枪发射的高速电子会与气体分子发生碰撞，产生电子散射，影响像的质量和反差；此外，在电子枪中会产生高压放电，气体会腐蚀灯丝，影响灯丝寿命，还会污染样品。3. 电子学系统电镜所用的电源比较复杂，同时对电源的稳定性要求很高。在总的电源的供给上要求用专用线，对电源要先进行交流稳压，然后再进行整流、直流稳压，最后供给各部分使用。主要的电源供给包括高压电源、电子枪灯丝电源等。4. 冷却系统 作用：防止机器过热。二、透射电镜的成像原理透射电子显微镜成像系统
9、包括样品室、物镜、中间镜、反差光栏、衍射光栏、投射镜以及其它电子光学部件。样品室有一套机构，保证样品经常更换时不破坏主体的真空。样品可在X、Y 二方向移动，以便找到所要观察的位置。经过会聚镜得到的平行电子束照射到样品上，穿过样品后就带有反映样品特征的信息，经物镜和反差光栏作用形成一次电子图象，再经中间镜和投射镜放大一次后，在荧光屏上得到最后的电子图象。照明系统提供了一束相干性很好的照明电子束，这些电子穿越样品后便携带样品的结构信息，沿各自不同的方向传播物镜将来自样品不同部位、传播方向相同的电子在其背焦面上会聚为一个斑点，沿不同方向传播的电子相应地形成不同的斑点，其中散射角为零的直射束被会聚于物
10、镜的焦点，形成中心斑点这样，在物镜的背焦面上便形成了衍射图像而在物镜的像平面上，这些电子束重新组合相干成像通过调整中间镜的透镜电流，使中间镜的物平面与物镜的背焦面重合，可在荧光屏上得到衍射图像，若使中间镜的物平面与物镜的像平面重合则得到电子显微镜图像，通过两个中间镜相互配合，可实现在较大范围内调整相机长度和放大倍数。第三节 扫描电子显微镜第四节 分析电子显微镜第二章 电子显微镜生物样品的制备第一节 超薄切片法制备超薄切片的方法包括：普通超薄切片法、冰冻超薄切片法快速冰冻置换法普通超薄切片主要步骤分为组织处理、超薄切片和电子染色三个阶段。一、组织处理（组织处理的必要性）（一）取材1、取材的要求：
11、快、小、准、冷、细、标记（1）操作迅速熟练：动物材料在中断血液供应后，其细微结构几乎立刻开始发生改变，故要求取材动作要迅速熟练，不致因耗时多而引起死后变化。（2）组织块体积小：制备电镜标本所用固定剂穿透能力弱，同时包埋剂的渗透能力也是有限的，为确保固定剂和包埋剂充分渗透到组织的各个部位，一般要求组织块体积以1mm3 为宜，因此，组织离体后，细切为 1mm3 或更小的组织块是非常重要的。在超微病理活检中，常会遇到因组织块过大，未经细切而引起组织自溶等人工损伤，失去诊断价值。（3）取材部位准确：根据研究目的和观察对象的要求，确定取材的位置。在临床病理活检时，要特别注意多点取材，避免电镜一孔之见的弊
12、病，才能对病变组织器官有全面了解，不致做出错误的诊断或评价。（4）低温下操作：脱离血循环的生物材料，细胞内的各种水解酶可以引起蛋白质、核酸水解，自溶作用使细胞的超微结构发生变化。为了减少细胞水解酶自溶作用的影响，要求在低温（0-4）下进行取材，固定剂和取材器械、容器等应预冷。（5）操作细致：电镜取材的过程要求动作迅速，但不能粗糙。应尽可能地动作轻巧，所使用刀片器械等锋利得手，切割时避免牵、拉、压、挤，防止细胞的机械损伤。（6）做好标记：进行电镜观察的目的无非是科学研究和病理诊断，因而组织块投入固定液小瓶时，应注意做好标记，在瓶签上著名组别、编号等，在取材以后得处理过程中也要注意这个问题。2、实
13、验动物取材：1mm 3 大小，12 分钟投入固定液。3、临床活检取材（1）外科活检： 14mm 厚，修成 1mm3 大小；（2）针刺活检： 迅速投入固定液并细切成 1mm 长的小段。（二）固定1、固定的目的利用化学的或物理的方法，终止细胞的死后变化，尽可能完整地保存细胞生活状态下的结构和成分。避免因细胞自身酶的分解作用而出现自溶或因外界微生物而发生腐败，致使细胞超微结构遭受破坏。2、理想固定剂与良好固定的标准（1）理想的固定剂应具备的条件穿透力强；能够稳定细胞的结构和化学成分，使其保持在原位；将细胞内的成分（蛋白质、脂类等）变为不溶状态；保存细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能集团，以供电
14、镜细胞化学测定；能够增强图像的反差。（2）良好固定的形态学标准：固定效果良好时，一般来说细胞的膜系结构线条清晰、连续而不断裂、细胞基质中充满均匀的精细颗粒，不见明显的空白区和颗粒聚集现象。细胞核结构（核膜、核仁、染色质等）层次清晰，无染色质不规则的聚集和异常的空白区。3、影响固定的因素（1）PH 7.27.4（2）渗透压 （3）时间 取得充分的固定效果而时间尽可能短（4）温度 04（5）固定液的浓度 四氧化锇 1%，醛类 1%4%（6）固定液的用量 1020 倍于组织块的体积4、常用固定剂（1）常用四氧化锇（OSO4）优点：对脂类有良好的固定效果；强氧化剂，与氮原子亲和力强，与蛋白分子形成交联
15、，稳定蛋白质；锇与固定的细胞成分结合后使图像反差增高，即“电子染色”作用；组织块不发生变形，不收缩和膨胀。缺点：对糖类与核酸的固定效果差；因其分子较大，穿透力弱，进入组织速度较慢；是酶的钝化剂，使细胞酶活性降低，不宜用于细胞化学研究；固定时间过长会使组织变脆，细胞成分抽提；其熔点较低，易挥发出蒸汽，伤害眼鼻等粘膜；价格昂贵。（2）戊二醛：优点：有两个醛基，可很好地固定蛋白质；对糖原和糖蛋白有良好的保护作用，弥补了 OSO4 的不足；渗透力优于 OSO4；能很好地保存酶活性，可用于细胞化学的研究；可较长时间保存固定组织，适于临床和野外取材远距离携带或邮寄。 缺点：对脂类固定效果差，无电子染色作用
16、，不能增加图像的反差。通常将戊二醛和四氧化哦联合作双固定，即戊二醛前固定，四氧化锇后固定。（3）多聚甲醛：渗透力强，固定迅速，可以良好的固定结构致密的组织。多聚甲醛和戊二醛常结合使用。（4）高锰酸钾：强氧化剂，是磷脂蛋白的良好固定剂，可用于细胞膜性结构的固定。5、固定方式：（1）双固定法：常用戊二醛作前固定，OsO4 作后固定。适用于大多数情况（2）体内原位固定法（3）灌注固定法：特别适于解剖取材困难的柔软组织或难以渗透、死后变化快的组织和器官。（三）漂洗 1、目的：前固定后使用配制固定液所用同系缓冲液充分漂洗，以除去残留的固定液，双重固定时，必须将戊二醛洗净，才能进入四氧化锇；四氧化锇固定后，必须充分洗去残留的四氧化锇，以免其与脱水剂作用。2、方法：0.1molPBS10min/次，共 3 次（四）脱水1、目的包埋介质充分渗透到组织内部；水分残留会导致电镜在真空状态下引起样品的急剧变化而无法观察。2、常用脱水剂：乙醇
