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1、祁连山地区药用植物根际产功能酶放线菌的筛选摘 要 本研究旨在探讨祁连山地区 8 种药用植物根际放线菌的产酶特性，以筛选功能酶产生菌，为后续研究提供参考菌种。采用含有 75ug|/mL 重铬酸钾和 2ug/mL 青霉素的甘油精氨酸琼脂培养基，并对土样做了 120x 1h 的加热预处理，利用稀释平板涂布法对 8 种药用植物根系土壤样品进行分离。之后利用 7 种筛选培养基对所得菌株定性检测，从祁连山地区所得的 8 种药用植物根际土壤样品中获得 18 株放线菌，功能酶筛选结果表明：10 株放线菌产淀粉酶，14 株产蛋白酶，14 株产脲酶，18 株产过氧化氢酶，4 株产聚氧乙烯山梨酸醇单月桂酸酯酶，8
2、株产聚氧乙烯山梨酸醇单油酸酯酶，15 株产聚氧乙烯山梨酸醇脂肪酸酯酶，0 株产色氨酸酶，0 株产纤维素酶。有两株菌产 H2S，18 株放线菌在糖代谢过程中均无有机酸产生。 关键词 祁连山 植物根际 放线菌 功能酶 0 前言 胞外水解酶诸如淀粉酶、蛋白酶、脂酶等在食品业、饲料添加剂、生物医学科学及化工工业等行业具有潜在的应用价值。工业生产一般是在特殊的物理化学条件下进行的，而在这个过程中起重要作用的酶制剂需要合适的反应条件才能达到最佳酶活，然而通常情况下这种最佳反应条件很难达到。因此寻找能够适应特殊环境条件的酶制剂是关键。放线菌是一类能够产生多?N 生物活性物质的微生物资源，如酶、抗生素、氨基酸
3、、维生素、有机酸、生物碱等均由其产生。 植物根际是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根部的区域。在植物根际区域内生长的微生物称为根际微生物。因此，植物根际微生物是一类值得深入研究与开发的微生物资源，从根际微生物的代谢产物中寻找各种生物活性物质是改善工业生产条件的又一重要途径。 目前，还没有针对我国祁连山地区药用植物根际放线菌资源的研究报道，本文采用了稀有放线菌资源选择性分离方法，对采自祁连山地区不同海拔梯度、不通植被类型的不同药用植物根系土壤放线菌进行分离，并对所得菌株做了部分生理活性测定，对功能酶产生菌做了筛选。 1 材料与方法 1.1 土样来源及处理 2010 年 7 月下旬从祁连
4、山地区选取 7 个不同植被类型、不同海拔梯度的样区，采集到 29 份代表性植物的根际土，各约 100g，分装于自封袋中，贴上标签后带回实验室，以供分离放线菌之用。土样概况及药用植物的药理功能见表 1。 1.2 菌种分离 1.2.1 分离培养基 培养基采用甘油精氨酸琼脂：精氨酸 2.0g；NaCl 50g；甘油 12.5g； FeSO4 7H2O 0.01g；MgSO4 7H2O 0.5g；K2HPO4 1g；CuSO4 5H2O 0.0001g；ZnSO4 7 H2O 0.0001g；MnSO4 H2O 0.0001g 蒸馏水1000mL；琼脂 20g；调节 pH 至 8.0 以上。 1.2.
5、2 分离方法 称取 3g 土样于 120干热处理 1h，用 27mL6%的酵母提取物溶液和 270ul5%的 SDS 溶液的混合液作为土样提取液。采用稀释涂布平板法进行分离。 1.3 代谢产物测定 1.3.1 MR 实验 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K2HPO4 5g，蒸馏水 1000ml。 1.3.2 硫化氢的产生 柴斯纳培养基：蛋白胨 10g，柠檬酸铁 0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.2，121灭菌 20min。 1.4 功能酶产生菌的筛选 1.4.1 色氨酸酶 培养基：1%胰胨水溶液，调 pH7.27.6，分装 1/41/3 试管；115灭菌 30min。 试剂：对二甲基氨
6、基苯甲醛 8g，乙醇（95%）760ml，浓HCl160ml。 1.4.2 过氧化氢酶 试剂：配 3%10%过氧化氢溶液 1.4.3 脲酶 培养基：蛋白胨 1g，NaCl5g，葡萄糖 1g，KH2PO4 2g，酚红0.012g，琼脂 15g，蒸馏水 1000ml，pH6.86.9（微黄） 。121灭菌 20min。 试剂：30%的尿素，用乙醚消毒。待培养基冷至 55时将无菌尿素加入，使尿素终浓度为 2%。 1.4.4 脂酶 培养基：蛋白胨 1g，NaCl 5g，CaCl2 ?7H2O 0.1g，琼脂 9g，蒸馏水 1000ml，pH7.4，于 121灭菌 20min。 底物：吐温-20、吐温-
7、40、吐温-80 分别于 121灭菌 20min。 1.4.5 蛋白酶 培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 20g，明胶 200g，蒸馏水 1000ml。 1.4.6 淀粉酶 淀粉水解培养基：可溶性淀粉 10g，K2HPO4 0.3g，MgCO3 1g，NaCl 0.5g，KNO3 1g 琼脂粉 20g；蒸馏水1000ml；pH7.27.4。 1.4.7 纤维素酶 纤维素水解培养基（pH7.2）：MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g， K2HPO4 0.5g， KNO3 1g；蒸馏水 1000ml，滤纸条。 2 结果 2.1 代谢产物测定结果 01、16 两株菌产生硫化氢，所有菌株 MR 实验皆
8、为阴性。 2.2 功能酶产生菌筛选结果 3 结论 本研究对祁连山地区 8 种药用植物根际土壤中分离到的 18 株形态各异的放线菌做了代谢产物测定和功能酶菌株筛选，检测结果发现 18 株放线菌中有 10 株放线菌产淀粉酶，14 株产蛋白酶，14 株产脲酶，18 株产过氧化氢酶，4 株产聚氧乙烯山梨酸醇单月桂酸酯酶，8 株产聚氧乙烯山梨酸醇单油酸酯酶，15 株产聚氧乙烯山梨酸醇脂肪酸酯酶，0 株产色氨酸酶，0 株产纤维素酶。其中菌株 QL15 除不产纤维素酶和色氨酸酶外，同时产其他 7 种酶。有两株菌产H2S，18 株放线菌在糖代谢过程中均无有机酸产生。 项目来源：西北民族大学 2016 年本科生
9、科研创新项目，项目编号：UPIP16222。 参考文献 1 司美茹，薛泉宏，来航线.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究J.微生物学通报，2004，31（2）：61-65. 2 Rao et al.1998.Kulkarni et al.1999；Niehaus et al.1999；Pandey et al. 1999；2000. 3 李春俭，马玮，张福锁.根际对话及其对植物生长的影响J.植物营养与肥料学报，2008，14（1）：178-183. 4 陈伊，李舟，魏玉珍，张玉琴，李秋萍，韩宁宁，周建琴，高红，孙承航.根际放线菌 I06203431 产生的核苷类抗生素 3431 的研究J.生物学杂志，2009，26（4）.
