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1、濒危兰科药用植物 DNA 条形码鉴定摘要 兰科药用植物形态分类困难，此研究采用 DNA 条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK，psbA-trnH 和 ITS2 序列作为 DNA 条形码对已进行了形态鉴定的 49 属 135 种 163 份兰科药用植物样品进行分子鉴定，经 DNA 提取，PCR 扩增、双向测序及校对拼接后，将得到的序列在 GenBank 中进行 BLAST 比对，然后运用 MEGA 7.0 软件中的 Neighbor-joining （NJ）法构建物种系统进化树。结果表明，163 份样品均能成功提取 DNA；matK，psbA-trnH 和 ITS
2、2 序列的 PCR 扩增效率分别为100%，100%，98.77%；共获得 487 条序列，其中 345 条序列在GenBank 数据库中比对到了相应物种的序列，142 条为新增序列；运用 NJ 法构建的兰科药用植物系统进化树中，基于 matK 序列所构建的物种系统进化树要优于基于 psbA-trnH 和 ITS2 序列所构建的系统进化树。matK，psbA-trnH 和 ITS2 序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充，DNA 条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。 关键词 兰科；DNA 条形码；药用植物；分子鉴定 Abstract In this study，DNA barcod
3、ing was used to validate the traditional morphological classification of medicinal plants of Orchidaceae. The 163 samples of 135 species belong to 49 genera which have been confirmed by morphological identification were collected. Candidate sequences，including matK，psbA-trnH and ITS2 sequences，were
4、amplified，bidirectionally sequenced，and assembled. All the sequences were blasted to GenBank database at NCBI，then analyzed using Neighbor-joining tree method by MEGA 7.0. The results showed that the DNAs of 163 samples were successfully extracted. The amplification efficiency of matK，psbA-trnH and
5、ITS2 sequences were 100%，100% and 98.77%，respectively. The 487 sequences were obtained，345 sequences of which have matched corresponding sequences in the GenBank database and 142 sequences were new sequences. The topology of NJ tree which were constructed with the matK sequences was better than the
6、trees of psbA-trnH and ITS2 sequences. In conclusion，the matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were complementary and suitable for identification of medicinal plants of Orchidaceae. DNA barcoding can be used as an auxiliary means for identification of medicinal plants of Orchidaceae. Key words Orchidace
7、ae；DNA barcoding；medicinal plants；molecular identification 兰科 Orchidaceae 是世界性大科之一，包括地生、附生、菌类寄生等生活方式1，在全世界约有 800 属 20 00035 000 种2-4，Flora of China 中记载中国境内的野生兰科植物共有 194 属（中国特有属 11 个） 1 388 种（中国特有种 491 个）4。兰科植物中的许多物种因其形态高度进化，物种之间仅有极细微的差异，从形态上对其进行鉴定较困难。 自双名法确立以来的 250 多年里，人类共鉴定和描述了约 170万种生物5，但这仅仅占到分类学家
8、预计物种数量的 15%6。DNA条形码（DNA barcoding）是一种基于 DNA 序列进行生物物种鉴定的技术，即利用标准化的一个或者几个 DNA 片段进行序列分析，根据核苷酸序列差异，对物种进行快速和准确的鉴定7-9。传统物种分类学主要依据物种形态和解剖特点进行鉴定，受鉴定人员的知识结构、经验以及物种生长发育状态等因素的影响10。DNA 条形码分子鉴定法因是从分子水平对物种进行鉴定，突破了对经验的过度依赖，并且不受样品形态和取样部位的限制，鉴定稳定性和重复性高，操作?单，便于缺少分类学知识的人员进行物种鉴定，能极大缓解当前分类人才短缺的现状。DNA 条形码分子鉴定法通过构建系统进化树，可
9、加速隐存种和新物种的发现。通过信息平台建立物种 DNA 条形码数据库，易于实现数字化，实现资源共享11-15。目前，DNA条形码分子鉴定法已在多种类型的药用植物鉴定中得到了广泛应用，表现出较强的鉴定能力16-22。 在悠久的中医药发展过程中，劳动人民很早就利用一些兰科植物进行治病，在中国现存最早的药学专著神农本草经中就以赤箭、石斛、白芨之名记载了 3 种兰科植物。传统中医认为许多兰科药用植物具有生津止渴、润肺化痰、清热解毒、活血调经、软坚散结、祛风止痛、止血、定惊、敛疮等功效。兰科药用植物的药用部位一般为其全草、块茎或假鳞茎，一些常用物种，如天麻、石斛、白及、山慈菇等，均具有较高药用价值？由于
10、兰科药用植物形态分类较困难，很容易采集到形态相近的伪品而威胁到用药安全。因此，此研究运用 DNA 条形码分子鉴定法对兰科药用植物进行鉴定研究，筛选适合兰科药用植物分子鉴定的 DNA 条形码序列，探讨其在鉴定兰科药用植物上的可行性，从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类结果，保障用药安全。 1 材料 1.1 采集与鉴定 查阅中国数字植物标本馆（Chinese Virtual Herbarium，CVH，http：/ CVH 中的标本信息，在兰科药用植物分布较集中的区域进行重点调查采集。采集地主要包括：广西壮族自治区百色市境内的那坡县老虎跳自然保护区和乐业-凤山世界地质公园以及广东省深圳市梧桐山
11、脚下的“深圳市兰科植物保护研究中心” 。共采集了 49 属 135 种 163 份兰科药用植物，经过“深圳市兰科植物保护研究中心”饶文辉馆长和广西中医药研究院黄云峰副研究员等兰科专家鉴定。 1.2 采样区域概况 那坡县老虎跳自然保护区位于广西西南部的百色市那坡县，与云南东南部、越南北部相邻。该区域地理坐标为东经 1053110553 E，北纬 22562315 N，最高峰海拔 1 603 m；多年平均日照 1 404 h，年均温 18.8 ，10 的活动积温 6 026 ，无霜期 324 d；多年平均降水量 1 408 mm，蒸发量 1 388 mm；土壤主要为红壤、黄红壤、黄壤、石灰土等；气
12、候温和、雨热充沛，植被保存较好，属北热带气候带，地带性植被型以沟谷雨林和石灰岩山地季雨林为主，是中越边境植物多样性核心区域，兰科植物尤为丰富。广西乐业-凤山世界地质公园位于云贵高原向广西盆地过渡的斜坡地带，由相邻的乐业大石围国家地质公园和凤山岩溶国家地质公园组成，该区域地理坐标为东经 1061810706 E，北纬 24182450 N，海拔 2741 500 m，属亚热带气候，热量充沛，干湿季明显，每年 510 月为雨季，11 月至次年 4 月为旱季；该区域土壤多为由砂页岩风化的残积母质发育而成的红壤、黄壤和低海拔的褐红壤，局部有石灰土。广东省深圳市梧桐山脚下的“深圳市兰科植物保护研究中心”
13、保存着中国近千种原生兰科植物资源，被誉为“中国兰谷” ，该中心所在区域属南亚热带气候。 2 方法 2.1 DNA 提取、PCR 扩增和测序 2.1.1 DNA 提取 用 75%乙醇擦拭经 50 低温干燥的叶片样品，称取约 30 mg，经适当剪切后，将样品移入已灭菌的 2 mL 圆底 EP管中，并向 EP 管中加入一颗小钢珠，再放入高通量组织研磨仪（Sceintz Biotech Co.，China）中，在 50 Hz 频率下研磨 120 s后，加入核分离液（配方为：Tris-HCl （pH 8.0）终浓度 100 mmol?L-1，EDTA （pH 8.0）终浓度 20 mmol?L-1，Na
14、Cl 终浓度 0.7 mol?L-1，PVP-40 为 2%，以上各物质配成溶液后灭菌，使用之前加入 0.4%的 -巯基乙醇）23清洗 1 至多次（800 L/次）至上清液无色后，用移液枪吸去上清液，留沉淀，再向其中加入裂解液，混匀后，使用 56 水浴过夜（812 h） （对于新鲜样品或较易提取出 DNA 的样品，可置于 65 水浴锅中水浴 6090 min） ，再采用植物基因组 DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取兰科药用植物样品总基因组 DNA。详细操作步骤参见中药材 DNA条形码分子鉴定指导原则及试剂盒说明书。 2.1.2 PCR 扩增和测序 通过
15、查阅相关文献24-31，选择在兰科药用植物中使用较广泛的叶绿体基因组 matK 序列和 psbA-trnH 序列以及核基因组 ITS2 序列作为 DNA 条形码序列。扩增引物及 PCR 扩增程序详见相关文献23。采用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增情况，对出现清晰目的条带的样品进行纯化后，运用 ABI 3730XL 测序仪（Applied Biosystems Co.，USA）进行双向测序。 2.2 数据处理 使用 CodonCode Aligner V6.0.2 （CodonCode Co.，USA）软件对测序获得的序列进行质量分析和校对拼接，去除低?|量区和引物区，获得了 ITS2，psb
16、A-trnH，matK 这 3 种 DNA 条形码序列。再运用 MEGA 7.0 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis，USA）软件对候选条形码序列进行序列分析，用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，并用自举检验法Bootstrap 1 000 次检验各分支的支持率32。 3 结果与分析 3.1 DNA 提取及 PCR 扩增 将 163 份兰科药用植物样品用核分离液洗后，加入裂解液，用56 水浴过夜（812 h） ，以保证样品中的 DNA 能够充分溶出，提高 DNA 提取的成功率。之后，严格按照 DNA 提取试剂盒的操作步骤进行操作。163 份兰科药用植物样品 DNA 均成功提取。PCR 扩增后，样品经
