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1、血浆同型半胱氨酸水平正常值与检测方法2011-2-10 13:39张曼 1 孙宁玲 21. 北京世纪坛医院 2. 北京大学人民医院近十多年的研究证实，血液中高浓度的同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是冠状动脉疾病、脑血管及外周血管疾病的独立危险因素【1-5】。因此，血浆Hcy 的实验室检测正逐渐受到重视。鉴于临床应用的需求在逐渐增多,临床医生对 Hcy 的病理生理意义和临床意义的理解也在逐渐提高, 但临床医师对目前血浆 Hcy 的检测及界定值的认识还缺乏统一认识，因此，本文拟就相关内容作一述评。1. Hcy 概述Hcy 是由蛋氨酸去甲基生成的一种含硫氨基酸,它在体内主要通过再甲基
2、化、转硫作用两种途径进行代谢：其一，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以维生素B12 为辅酶，以 N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，Hcy 被甲基化生成蛋氨酸。此过程的关键酶是以维生素 B2 为辅酶的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，该酶使N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原为 N5-甲基四氢叶酸，其作用非常重要;其二，Hcy 与丝氨酸结合，在胱硫醚-合成酶(CBS)催化作用下，以维生素 B6 为辅酶，生成胱硫醚，后者再裂解为半胱氨酸和 -酮丁酸，参与代谢，形成转硫化途径。当上述代谢途径受阻时，Hcy 在细胞内蓄积，并进入血液循环，引起慢性病理损害。参与 Hcy 代谢的酶(如 MTHFR 和 CBS)如有
3、遗传缺陷可导致严重的高Hcy 血症，而由于营养因素导致的维生素 B6、B12 和叶酸的缺乏同样可产生高Hcy 血症。就与冠心病、脑卒中的关系而言，营养因素(包括烹调、饮食习惯)在目前可能更为多见、更为重要。除遗传、营养因素外，年龄、种族、生活习惯(如吸烟、饮酒、高蛋氨酸食物等)、药物和某些疾病因素等也可以不同程度地影响血浆 Hcy 水平。血浆中约 75%的 Hcy 与白蛋白结合，形成结合型 Hcy，其余的则主要以二硫键结合的 Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在，为游离型;只有 12%以还原型 Hcy 存在于血浆中。通常测定的是血浆中所有形式 Hcy 总和，即总Hcy(total H
4、omocysteine,tHcy)。2. Hcy 界值与心脑血管疾病风险预测一般认为，血浆 tHcy 正常值参考范围为 515mol/L(高效液相色谱法)，当血浆 tHcy15mol/L 时，即为高 Hcy 血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy);也有学者认为正常健康人血浆 tHcy 应小于 12mol/L【6】。当血浆tHcy40mol/L 时即超出肾阈值，可出现同型半胱氨酸尿，这种情况主要见于遗传病。单测一次空腹血浆 tHcy 会使 55%高 Hcy 血症漏诊，故国际上采用蛋氨酸负荷试验增加高 Hcy 血症的检出率。Boushey 等人发现，男性血浆 tHcy 浓度介于
5、 9.014.9mol/L 者，其患冠心病的危险性是低于 9.0mol/L 者的 2 倍，而高于 14.9mol/L 者，其危险性则增加 6 倍，因此 Boushey 于 1995 年建议理想的血浆 tHcy 浓度应低于10mol/L【7】。Guilliams【8】认为，Hcy 不再是血管性疾病的一个标记物，而是一个致病因子。作者列举下列基于临床资料的统计学模型来阐明血浆 tHcy 水平与冠心病风险的关系：当 Hcy 为 6.5mol/L 时，患冠心病的风险比已超过 1，以后随着 Hcy 上升，特别是大于 10mol/L 后，冠心病风险也几乎呈线性上升，直到Hcy 水平达 20mol/L 以上
6、时才趋于效应平台，但此时风险比已近 12。2004 年，在 Toole 等人【9】进行的著名“预防脑卒中的维生素干预RCT 试验”(VISP 试验)中，明确定义男性 Hcy9.5mol/L、女性Hcy8.5mol/L 即为轻到中度高 Hcy 血症患者，并纳入为受试人群。该试验虽未证实高剂量维生素较之低剂量维生素更有益于预防脑卒中，但明确显示脑卒中风险与血浆 Hcy 水平之间的相关性。后来，在排除了 VISP 试验中肾功能不全及维生素 B12 状态因素后的再分析结果表明，脑卒中风险降低 21%。Arauz 等人【10】在 39 名由颈动脉剥离引起的脑梗塞患者中观察到血浆 Hcy 平均水平仅为 9
7、.81mol/L，但显著高于对照组的 6.38mol/L。2006 年，美国高血压协会(ASH)和脑卒中协会(ASA)发布了对于缺血性脑卒中和短暂脑缺血发作患者的卒中预防指南【11】。在该指南里，高 Hcy 血症被列为脑卒中的重要风险因子之一，并定义 Hcy10mol/L 即为高 Hcy 血症，建议给予患者补充维生素 B6、B12 和叶酸。2009 年，我国台湾学者 Sun 等【12】为确定血浆 Hcy 预测心血管疾病风险的临界值，调查了总共 2009 人的队列，并已追踪随访 13 年。结果发现，当Hcy9.47mol/L 时，心血管事件风险增加 2.3 倍，而当 Hcy11.84mol/L
8、时，全因死亡风险增加 2.4 倍。因此，作者认为：血浆 Hcy 水平与心血管事件及全因死亡有显著关联性，9.47mol/L 和 11.84mol/L 可确定分别为 Hcy 预测心血管事件风险及死亡风险的界值。综上所述，基于心脑血管疾病“预防第一”原则，对血浆 tHcy 正常值范围的界定应宜低不宜高，10mol/L 可视为 Hcy 预测心脑血管事件风险的临界值，一旦血浆 tHcy10mol/L，即应提倡进行早期干预治疗和“零级预防”心脑血管事件，如补充叶酸和/或其它固定复方制剂如依那普利叶酸片、和/或 B 族维生素等，从而有效预防心脑血管事件的发生。另外一旦合并高血压(即 H 型高血压)，根据已
9、有研究显示，心脑血管事件风险显著增加, 高血压患者tHcy10mol/L 时，心脑血管事件风险比正常人增加 10-30 倍，如果同时为MTHFRC677T 的 TT 纯合突变基因型携带者，风险可高达 40 倍以上，因此tHcy10mol/L 即可视为高危，而 tHcy15mol/L 则可视为极高危。3. Hcy 检测方法(1)同位素法 通过 14C 标记的腺苷与 tHcy 缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测定 tHcy 浓度。该法灵敏度高、特异性强，但由于操作繁琐且有放射污染，虽经改良也未能推广使用。(2)高效液相色谱法(HPLC) 是目前比较成熟且可推广使用的方法，方法学包括柱前衍
10、生-HPLC-荧光检测法，HPLC-柱后衍生-紫外检测法或荧光检测法和HPLC-电化学检测法。目前已有 tHcy 全自动的 HPLC-荧光检测仪问世。Bartesaghi 等人【13】建立的不用内标 HPLC 法同样具有良好的分离效果，测定精度和分析速度可用于大样本分析。(3)荧光偏振免疫检测(FPLA)法 该方法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，故短时期内不易普及。检测时，首先用二巯基苏糖醇将结合型 Hcy 还原出来，然后通过特异性的 S 腺苷 Hcy 合成酶催化 Hcy 转变为 S 腺苷 Hcy，与作为示踪物的荧光素标记 S 腺苷 Hcy 类似物一起与特异性单克隆抗体竞争性结合，引起示踪物
11、偏光性改变，从而检测出 Hcy 浓度。(4)酶免疫测定法 这种方法也需要将 Hcy 先转化为 S 腺苷 Hcy，然后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，最后加入辣根过氧化物酶的底物，并在450nm 处检测。加入蛋氨酸与半胱氨酸对检测结果均无影响，无交叉反应。这种方法的检测结果与 HPLC 检测结果的相关系数达 0.986。(5)循环酶法 是近年发展起来、可用于自动生化分析仪的一种技术，它使tHcy 检测更加快速、方便。其原理是结合的 Hcy(氧化形式)被还原成游离的Hcy，在胱硫醚-合成酶的催化下和丝氨酸反应生成 L-胱硫醚，后者被胱硫醚-裂解酶分解成 Hcy 和丙酮酸，丙酮酸参与 NADH
12、显色反应，生成的 Hcy 再次参与第一步反应，如此循环。该方法与 HPLC 法相关性良好，无需样本预处理，目前正被国内外广泛采用。综上所述在 Hcy 的检测方法上，循环酶法(生化法)更简便、易行，有利于各医院的检测，可以在临床广泛采纳。4. 同型半胱氨酸检测的临床意义: 已知同型半胱氨酸的代谢与维生素和叶酸的代谢有关，当叶酸代谢异常或缺乏时可呈现高 Hcy，高 Hcy 可通过炎症反应途径使血管的结构和功能发生障碍，产生心脑血管疾病。最新文献研究陆续提示，高 Hcy 不仅与出生缺陷和心脑血管事件风险增加密切相关，而且也与许多常见病如血管性认知功能损害、老年痴呆、骨质疏松症等有关。已知高血压、糖尿
13、病患者有部分的高 Hcy 现象，同时心血管和脑血管疾病的患者以及肾功能障碍的患者(Hcy 的排泄异常)均可使血浆中 Hcy 增高，因此目前的研究已经证实高 Hcy 血症是心脑血管疾病的危险因素，是需要治疗的。我国是高卒中发生国家，心血管疾病的发生也在逐年增加，在此背景下，我们除了要关注传统的危险因素外，对高 Hcy 现象，尤其是合并高血压的患者，应给于重视，及早的检出，积极地综合干预，有利于我国心脑血管疾病早期防治。参考文献1 Herrmann W. Significance of hyperhomocysteinemia. Clin Lab. 2006, 52(7-8): 367-374.2
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