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1、80 中国中医药咨讯 Journal of China Traditional Chinese Medicine Information 2010年5月上第2卷第9期 May 2010 VoL2 No9 T细胞受体V p亚家族基因表达特点与特发性血小板 减少性紫癜临床疗效的相关性 范建新 (山西 八学第二医院血液科，山西太原，030001) -【摘要】目的研究特发性血小板减少性紫癫(ITP)患者T细胞受体p链可变区互补决定区3(TCRpVCDR3)基因表达的 变化，与rrP临床治疗效果之间的关系。方法采用RTPCR方法分析15例缓解组ITP患者、10例复发难治组ITP患者和6例 正常对照组T细
2、胞受体13链frCR B)的可变区(v)的24个家族的互补决定区3(CDR3)基因序列。结果15例缓解组I I1P患者见 部分CDR3基因谱型异常，平均每个患者基因异常的家族数为255O38个，未见T细胞克隆增生。1O例复发难治组nP患 者中，在8V8、BV131、BVI4和pV17等亚家族都出现了克隆性增生，平均每个患者异常家族为71315个，明显高于正 常对照组，差异有统计学意义(POo5)Abnarmal CDR3 distribution could be observed apparently difierent between refrscto- rynPpatients and
3、healthy controls(P(OOO1)，with oligoclonality at all average value of71315 perpersonInV138、VB131、V1314 and V 13 17 subfamily，common clonal T cell expansions could be observedConclusion Clinically lenitive ITP group and refractory ITP group have different relations with T cells related immunityTCR B V
4、 CDR3 size distribution can help find abnormal T cell clones，which may contribute to the diagnosis，discrimination and therapy of different types of ITP 【Key wordsidiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)；T cell receptor(TCR)；TCR p V；CDR3 特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，rrP)，是由于大量血小板被自
5、身单核巨噬系统吞 噬，目前认为主要原因在于机体产生抗自身血小板抗体_Il。 糖皮质激素(泼尼松 认为IrrP的首选药物I21。目前对于应 用泼尼松和脾切除治疗无效的ITP患者的治疗相当困难。 研究表明难治性rrP与缓解型ITP产生抗体的机理不同， 患者体内存在着自体反应性T细胞31。人种之间T细胞反 应存在异质性fIl。难治性ITP可能由于 异常而引导自身 反应B细胞分化并分泌自身抗体51。 研究T细胞克隆特征最常用的方法是研究TCR B链 的多态性吗。T细胞受体(，Icell receptoL TCR)可变区vari able，V)的互补决定簇3(complementarity determ
6、ining region， CDR3)是TCR与抗原直接结合的部位，具有多态性。某些 病毒感染者和肿瘤患者可以出现发生优势扩增的T细胞 克隆171。Shimomura等罔发现，难治性ITP患者外周血中出现 了寡克隆CD4 细胞的积聚，Fogarty等【 发现，脾切除治 疗后无反应者体内存在有非常明显的V p 3、V B 15亚家族 的T细胞克隆性增生。但是，ITP患者中是否都有T细胞克 隆性增生，缓解型ITP、难治性ITP有无差别，目前尚无研 究报道。 本实验采用变性凝胶电泳技术，分析CDR3基因表达 谱图，分析T细胞各个克隆的CDR3改变。探讨自身反应T 细胞在ITP发病过程中所起的作用，分
7、析其与ITP临床治 疗效果的关系。 材料和方法 1研究对象 11缓解ITP组20083200812在山西医科大学第 二医院血液科门诊就医的l5例缓解ITP患者，男性6例， 女性9例，年龄144岁，中位年龄l9岁。 12难治ITP组20083200812在山西医科大学第 二医院血液科门诊就医的10例难治ITP患者，其中1例脾 切除术后无效采血，另2例激素治疗无效后采血。男性5 例，女性5例，年龄1_47岁，中位年龄25岁。所有病例均经 临床观察、骨髓形态学+免疫组化得到确诊，符合ITP诊断 的标准l】0l。 13正常对照组6例，为门诊体检的正常患者，取外周 2010年5月 第2卷第9期 May
8、2010 Vd2 No 9 中国中医药咨讯 Journal of Chind Traditiona1 Chinese Medieine ihf0rmation 8l 血，其血常规正常，无感染征象及自身免疫性疾病，男女各 3例，年龄645岁，中位年龄26岁。 2主要试剂 TRizol试剂、MMIJv反转录酶、随机引物、dNTP TEMED，DEPC及尿素(超纯)均购自美国Promega公司， RNasin购自大连宝生物生物工程公司，引物均由北京赛百 盛生物技术服务有限公司合成，Taq酶购自大连宝生物生 物工程公司。 3实验方法 31末梢血单核细胞的分离 标本均采自外周血，活细胞检测胎盘兰拒染率应
9、为 9295，外周血单个核细胞的分离按常规方法进行。 32 RNA提取和cDNA合成RNA提取应用RNAzol试 剂盒(Gibco，BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Su perscript，Gibco，BRL)反转录合成cDNA第一链。均按常 规方法进行。 33引物用于非标记PCR的24个Vp引物和C p引 物1 l】，均由北京赛百盛生物技术服务有限公司合成。 34 RTPCR PCR按已报道的方法进行2 4。总反应 体积为25 1，其中含1 i cDNA，任V13引物(24个V13 引物之一)和Cp弓I物(05 molL)，01mmolL dNTP， i25 U Taq聚合酶和1PE
10、R缓冲液。反应在PCR扩增仪 中进行。共进行4O循环，每一循环包括：94 oC 1min(首次 3rain)，60 oC Irain和721rain(末次lOmln)，PCR产物保 存于4。C中备用。 35 45变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(含40尿素)： 取5 lPCR产物加5 l等量的上样缓冲液，92T；变 性10 rain后立即置冰上，以防止DNA复性，上样后，1200 v恒压电泳35小时，二甲苯青电泳至凝胶的下13处时， 停止电泳。 36银染 电泳后的变性聚丙烯酰胺凝胶用1AgN03 f20Ag NO3 20 ml加去离子水至400 ml1预染20分钟，去离子水 冲洗1遍，加入显色液(15N
11、aOH，001NaBH4，01甲 醛)显色至条带清晰为止，用自来水冲洗1遍，然后用75 乙醇脱水2分钟，30一50的甘油浸泡1分钟，用玻璃纸 封胶并干燥。 37用ImageScanner II扫描仪(美国美国安玛西亚公司) 扫描凝胶，扫描后对每个标本每个家族的条带行数目及浓 度的比较。 38统计学分析用统计学软件SPSS 170进行统计分析， 多个样本均数间的比较采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，以P005，表1)，15例缓解ITP患者未出现共同增生的T 细胞克隆。 图2 1例缓解ITP患者的TCR日VCDR3基因谱型 图 可见大部分家族呈现正态高斯分布，$V4，p V51亚 家
12、族出现寡克隆增生条带f变性聚丙烯酰胺凝胶分离、银染) 3难治性rrP组 对l0例难治ITP患者外周血TCR p V各家族进行了 检测，发现部分TCR 13 V家族CDR3基因谱型表达发生异 常，表现为家族内部的条带发生了克隆性增生、减弱或缺失 f图3)，平均每个难治ITP患者外周血TCR p V CDR3基因 谱型发生异常的家族数为71315个，明显高于正常对照 (P005；“”表示和正 常对照组相比P005)，未出现相 同的TCR p V亚家族内发生共同增生的T细胞克隆；而 1O例难治rrP患者的不同的TCR B V家族内可以看到 2-11个寡克隆条带，其中BV8、pV131、pV14、pV
13、17家 族内更容易见到寡克隆增生，而其他的T细胞克隆表达数 量降低，与正常对照组相比，其基因谱异常家族数的差异具 有统计学意义(P005)。这个结果直接证明：缓解ITP、难治 ITP的发病与T细胞免疫的关系是不同的。 本实验应用TCR B V基因谱型检测，发现在难治性 ITP中确实存在着克隆样增生的T细胞，如能确定这些克 隆性增生的T细胞确实能识别rrP中的自身抗原，并针对 关键的CDR3氨基酸序列制备出抗体或者DNA疫苗，就有 望阐明ITP的发病机制，发展出免疫治疗的新方法。 参考文献 1Berchtold2-Wenger,MAutoantibodies against platelet g
14、lyeo proteins in autoimmune thromboeytopenic purpura：their clinical signifi cance and response totreatmentBlood，1993，5：12461250 2Kappers-Klunne M C，vant Veer M BCyclosporin A for the treat ment of patients with chronic idiopathic thmmbo-cytopenic purpura re fractory to cortiscosteroids or splenec-to
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