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1、1杆状病毒转导的小鼠羊水干细胞保持成骨分化潜能的实验研究【摘要】 目的 探讨带有绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒修饰后的小鼠羊水干细胞(mouse amniotic fluid stem cells, mAFSs)是否仍保持成骨分化潜能。方法 体外原代培养小鼠羊水干细胞，并进行成脂成骨诱导分化，鉴定多向分化潜能；体外构建并扩增重组杆状病毒（Baculovirus-CMV-GFP, Bv-GFP） ；Bv-GFP 体外转导小鼠羊水干细胞，流式细胞仪检测其转导效率；经 Bv-GFP 基因修饰后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化。结果 小鼠羊水干细胞体外具有良好的增殖能力，3 代后的细胞呈现较均一的梭形
2、、漩涡状生长，且小鼠羊水干细胞体外具有成脂成骨分化潜能。体外成功构建重组杆状病毒，经 Sf9 细胞扩增后，极度稀释法测定其滴度可达109v.g/ml；Bv-GFP 体外可较有效转导小鼠羊水干细胞，其转导效率为 52.85，且经 Bv-GFP 基因修饰后的小鼠羊水干细胞仍保持成骨分化潜能。结论 小鼠羊水来源干细胞是一种理想的干细胞，杆状病毒是一种新型病毒基因载体，体外能较有效转导小鼠羊水干细胞且不改变其成骨分化潜能。经重组杆状病毒基因修饰的羊水干细胞会为今后的骨组织工程提供一种新的治疗模式。 【关键词】 杆状病毒 羊水细胞 基因修饰 成骨分化2【Abstract】 Objective To ex
3、plore whether the mouse amniotic fluid stem cells(mAFSs) maintain the potential of osteogenesis differentiation after gene modification by green fluorescent protein(GFP) labeled baculovirus. Methods mAFSs were primary cultured in vitro and were induced for osteogenic and adipogenic differentiation,
4、the multi-directional differentiation was identified. Baculovirus-CMV-GFP(Bv-GFP) was constructed and amplified, then it was transfected to mAFSs, the transfection efficiency was tested by flow cytometer; osteogenic differentiation was induced on the transfected stem cells. Results The mAFSs had goo
5、d proliferation capacity, cells were homogeneously spindle-shaped after 3 generations and grew in whirlpool manner, also they had osteogenic and adipogenic differentiation potential. The reconstructed baculovirus was successfully constructed, after Sf9 amplification, the tilter was 109v.g/ml after e
6、xtreme dilution method；Bv-GFP could effectively transfected mAFSs, with the transfecting rate at 52.85%, and remained osteogenic and differentiation potential after gene modification. Conclusions mAFSs are ideal stem cells, baculovirus is a new type of viral genetic vector, which can effectively tra
7、nsfect mAFSs without changing the osteogenic 3differentiation potential. MAFSs, after genetically modified by reconstructed baculovirus, provides a new treating mode for bone tissue engineering.【Key words】 Baculovirus Amniotic fluid stem cell Gene modification Differentiation of osteogenesis 外伤或手术时造
8、成的骨损伤如不能自行修复，则会造成骨不愈合或骨缺损,常需自体或异体骨移植，但其效果并不确切,不但增加了病人的痛苦和经济负担，同时又存在许多并发症1 。若在骨损伤的部位注入有成骨潜能的细胞并诱导其成骨分化，可能解决这一问题1，2 。干细胞的发现和深入研究为这个设想带来了希望。干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的一类细胞，一般分为胚胎干细胞和成体干细胞。常见的成体干细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞等，虽然大量的研究证实它们可以于体内外成骨分化2 ，但取材较困难，且成骨分化潜能较低2，3 ；胚胎干细胞虽然具有较好地成骨分化潜能，但因其受伦理道德的限制及体内具有致瘤可能性，应用受限4，5
9、 。最近的大量研究表明，羊水中亦存在干细胞，在体内外具有很好的增殖能力68 ，它具有胚胎干细胞的特性，如表达 SSEA、OCT-4 等胚胎干细胞表面标志6 9 ，同时羊水干细胞于体内外都具有较好的成骨分化潜能68 ，且其取材容易，无伦理道德限制，故对于骨组织的修复研究来说，羊水干细胞是一种理想的种子细胞10 。然而，干细胞在体内成骨分化受到多种4因素的影响11 ，若在体外对干细胞进行基因修饰，将会显著提高其在体内的成骨分化潜能11 。目前，常用的基因载体如腺病毒载体、慢病毒载体、质粒载体有诸多缺陷而限制了的临床应用12 。而杆状病毒包装载体容量大，对靶细胞无毒性作用，无致瘤性等优点13 ，是一
10、种理想的病毒基因载体，但重组杆状病毒是否可有效转导羊水干细胞，以及转导后的羊水干细胞是否保持成骨分化潜能，目前国内外还没有相关报道。本研究旨在探讨体外Bv-GFP 是否可有效转导小鼠羊水干细胞，以及对其成骨分化是否有影响，为今后的杆状病毒载体基因修饰羊水干细胞及运用于今后的骨组织重建工程研究奠定基础。1 材料和方法1.1 主要试剂及器材 低糖 DMEM 培养基（ L-DMEM） 、Grace培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、马血清、无钙镁PBS、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ） ，均购于美国 Gibco 公司；维生素 C、 -磷酸甘油，购于美国 Sigma
11、 公司，培养瓶、离心试管及培养皿，购于美国 Corning 公司；倒置荧光显微镜为日本Olympus 产品，流式细胞仪为美国 BD 公司产品。1.2 实验过程 （1）将 2 月龄昆明小鼠雌雄合笼，如第 2 天发现雌鼠阴部有白栓，即开始计时。取孕 12d 的小鼠，在水合氯醛麻醉5下，剖开腹部，用微量定量注射器在羊膜内取 0.3ml 左右的羊水，注入 3.5cm 的培养皿中,并加入含有 10%FBS、10ng ml-1bFGF、100U ml-1 青霉素和 100g ml-1 链霉素的 2ml 低糖DMEM 冲悬混匀。2d 后换液，可见有梭形贴壁细胞出现。12d 左右后，培养皿中贴壁的梭形细胞可长
12、至 80以上。吸去培养基，用PBS 洗 2 遍之后，加 0.25的胰酶消化，以 12 传代并细胞计数。以后每 2d 换一次液，细胞长至 90时，以 13 传代。(2)P5 代小鼠羊水干细胞传于培养皿中，待其长至 80以后，吸去完全培养基，用 PBS 洗 2 遍之后加入 2ml 成脂、成骨诱导液。成脂诱导液：低糖 DMEM 加入终浓度为 10胎牛血清、50g/ml 维生素 C、10-7mmol/L 地塞米松、50g/ml 吲哚美辛。成骨诱导液：低糖DMEM 加入终浓度为 10胎牛血清、50g/ml 维生素 C、10-8mmol/L 地塞米松、10mM/L -磷酸甘油。 mAFDSCs 经成脂或成
13、骨诱导液诱导之后，每 3d 换一次诱导液。 2 周后吸去成脂或成骨诱导液，PBS 洗 2 遍之后用 4多聚甲醛固定。用油红 O 对成脂诱导细胞染色，鉴定其成脂分化；用茜素红对成骨诱导细胞染色，鉴定其成骨分化。 （3）重组杆状病毒构建，扩增及滴度测定。运用Bac-to-Bac 操作系统（Life Technologies）成功构建 Bv-GFP，经Sf9 昆虫细胞扩增后，用极度稀释法进一步测其扩增后的病毒滴度。（4）当 25cm2 细胞培养瓶内 sf9 细胞长至 80时，加入 1ml Bv-GFP 病毒原液，并加入 1ml PBS 混匀后置于 37冰箱孵育 1h（摇晃 1 次/10min） ，之
14、后倒掉病毒液，PBS 洗 2 遍之后加入 3.5ml 6Grace 完全培养基，2d 后用胰酶消化细胞并离心，倒掉培养基后PBS 洗 2 遍，之后 1.5ml PBS 重悬 sf9 细胞并于液氮反复冻融 3 次后离心（2000r/min,10min ） ，缓慢吸出病毒上清液并以 13 的比例感染 sf9 细胞，最后扩增至 20 瓶 75cm2 培养瓶。反复冻融细胞收病毒，收集的病毒悬液于 27000g 离心 3h，PBS 重悬过夜，利用极度稀释法测定收集到的 Bv-GFP 的滴度。 （5）P6 代小鼠羊水干细胞种植于培养皿中，待其长至 80时，吸去培养基，用 PBS 洗 2遍之后进行杆状病毒转
15、导。依据培养皿中的细胞数，调整杆状病毒剂量，使感染指数（MOI）为 500v.g/cell，并加入 500l PBS 冲悬混匀病毒，将皿至于细胞培养箱孵育 4h。4h 之后吸去 PBS，加2.5ml 完全培养基于皿，并放置于 37细胞培养箱继续培养。 （6 ）杆状病毒转导后的小鼠羊水干细胞置于倒置荧光显微镜下,采用蓝光激发观察，发绿光的细胞定为阳性细胞。杆状病毒转导 3d 后的小鼠羊水干细胞用 PBS 洗 2 遍，0.25胰酶消化，移至离心管于1500r/min 离心 5min,用 500l PBS 重新悬浮，并吹散为单细胞悬液后使用流式细胞仪检测杆状病毒转导效率。每个细胞样品约（45）105
16、 个细胞，以未经杆状病毒载体转导的细胞作为对照。（7）经 Bv-GFP 转导后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化，以未经病毒转导的羊水干细胞作为对照，方法同上。2 实验结果72.1 小鼠羊水干细胞形态及其生长方式 见图 1。2.2 羊水干细胞成脂成骨 羊水干细胞成脂见图 2，羊水干细胞成骨见图 3。图 1 P5 代小鼠羊水干细胞（100）图 2 成脂诱导分化（400）图 3 成骨诱导分化（400）2.3 杆状病毒扩增、滴度测定 Bv-GFP 经 sf9 细胞扩增后，极度稀释法测定其滴度为 109v.g/ml。2.4 杆状病毒转导倒置荧光显微镜摄像 见图 4。2.5 流式检测 见图 5、6 。图 4 （200）图 5 阴性对照图 6 Bv-GFP 转导效率 522.6 对照组细胞诱导成骨、病毒转导组细胞诱导成见 见图87、8 。两组细胞成骨能力无明显差别，说明经杆状病毒基因载体转导后的
