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1、 EML4-ALK 融合基因与非小细胞肺癌中的研究进展赵静 余永伟 郑建明（第二军医大学附属长海医院病理科，上海 200433）摘要 棘皮动物微管结合蛋白 4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4)与间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)形成的融合基因被认为是非小细胞肺癌（NSCLC)新的分子靶点。EML4-ALK 的发生率为 3%-11%，该融合基因在年轻、腺癌、不吸烟或轻度吸烟的 NSCLC 患者中发生率较高，表达阳性者可以受益于 ALK 抑制剂（如克唑替尼）的治疗。本综述重点阐述
2、 NSCLC 中 EML4-ALK 融合基因的生物学特性，检测方法，临床特征和治疗方式。关键字 非小细胞肺癌；EML4-ALK;融合Reseach progress of EML4-ALK Fusion Gene in Non-small Cell Lung Cancer Jing Zhao, Yong-wei Yu, Jingming Zheng(Department of Pathology, Affiliated Changhai Hospital of Second Military Medical University, Shanghai , China 200433)Abstrac
3、t The fusion gene between echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4) and anaplastic lymphoma kinase(ALK) has recently been identified as a new molecular target of non-small cell lung cancers(NSCLC).EML4-ALK is about 3%-11% in patients with non-small-cell lung cancer ,The fusion gene has
4、 higher morbidity in NSCLC patients who are young , never or light smoking history and adenocarcinomas. ALK inhibitor (crizotinib) has demonstrated a remarkable clinical efficacy in EML4-ALK positive NSCLC ptients. This review emphasizes the biological,detection method,clinical characteristics and t
5、he therapeutic application of EML4-ALK in NSCLC.Key Words Non-small cell lung cancer; EML4-ALK; fusion oncogene肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率居世界首位。其中 75%80%为非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer，NSCLC） ，5 年的总生存率越为 10%15% 1，由于肺癌的早期发现率低，多数 NS 患者确诊时即为晚期，已失去手术的机会，对于这些患者，放化疗为其治疗手段，但放化疗普遍存在的毒副反应又令多数患者望而生畏 2。随着对肿瘤发病机制及
6、其生物学行为研究的不断深入，针对这些发病机制的信号传导通路小分子抑制剂或单克隆抗体已逐步进入临床，人们越来越多的把焦点聚向了以特异性高、不良反应轻为特点的分子靶向治疗,目前临床较常用的肺癌分子靶向治疗有：针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor re-ceptor，EGFR)突变的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)易瑞沙（吉非替尼, Iressa 或 ZD1839） ，特罗凯（厄洛替尼，erlotinib 或OSI-774）和爱必妥（西妥昔单抗，IMCC225，cetuximab） 。这些单克隆抗体可以阻断 EGFR
7、 介导的信号传导，从而抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞生命周期的延长、抑制肿瘤侵入周围组织和促进肿瘤细胞的凋亡 3。近作者简介：赵静(1986-),女,本科，技师.Email:jinni_.通讯作者郑建明(Jian-ming Zheng,corresponding author),02131162270，Email: 期发现 NSCLC 患者中存在除 EGFR 突变、KRAS 突变之外的另一个重要的酪氨酸激酶抑制剂的作用靶点EML4-ALK 融合基因，即棘皮动物微管结合蛋白 4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4) 与间
8、变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因。这一融合基因表达阳性的肺癌患者可以受益于 ALK 抑制剂（如克唑替尼）的治疗。有研究提示，在肿瘤转移患者中 EML4-ALK 融合基因阳性与 EGFR-TKI 耐药相关 4。1 EML4-ALK 的生物学特性 ALK 于 1 9 9 4 年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤 AMS3 细胞株中 5，是由 1620 个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族。2007 年，来自日本的学 Soda6及其同事等在 1 名 62 岁有吸烟史的男性肺腺癌患者的肿瘤组织中首次发现 EML4-ALK 融合基因。EML4-ALK
9、融合基因的重排发生在 2 号染色体短臂上的 2 区 1 带和 2 区 3 带，相隔 10Mb 距离 ，由 ALK 基 因的 3端与 EML4 基因的 5倒位融合形成。在肺癌中，ALK 最常见的融合基因为 EML4，EML4 一 ALK 融合基因在大约 3 11的非小细胞肺癌中发生7。到目前为止，研究人员确认至少存在 9 种 EML4-ALK 融合基因变异体存在，分析这些融合基因的结构特点发现，ALK 部分均为 20 号外显子编码细胞内酪氨酸激酶结构基因片段，而 EML4 部分包括不同外显子的片段基因 (2、6、13、 14、15、18 和 20 号外显子 ).其中最常见的是 El3；A20(v
10、ariant 1)和E6ab；A20 (variant 3)，其发生率分别为 33和 29 8。 （见图 1 和图 2） 9图 1：NSCLC 中的 ALK 融合类型Fig 1 ALK fusion type in NSCLC备注：KIF5B: the kinesin family 5B gene（驱动蛋白家族 5B 基因） ；KLC1：the kinesin light chain 1（驱动蛋白轻链 1） ；TFG：TRK-fused gene（ TRK 融合基因，TRK：tropomycin-related kinase 原肌球蛋白相关的激酶） ；PTPN3：protein tyrosin
11、e phosphatase, non-receptor type 3（蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体 3 型） ；EML4-ALK：棘皮动物微管相关蛋白样 4-间变性淋巴瘤激酶图 2 NSCLC 中的 EML4-ALK 融合各型比例分配Fig 2 Proportion of various types of EML4-ALK fusion in NSCLC2 EML4 一 ALK 融合基因检测方法目前常用的方法有免疫组织化学(IHC)、 荧光原位杂交 (FISH)、和逆转录聚合酶链式反应法 （RTPCR） 。RTPCR 最早用于 EMIAALK 融合基因的检测，该方法快速灵敏，应用范围广，不但可同时
12、检测多个已知亚型，还可以结合测序技术发现新的亚型，可以对石蜡包埋组织进行测定，不足是扩增带来的假阳性难以避免 10。IHC 法优势是检测肿瘤特异性抗原表达，而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征，具有快速筛选作用，其不足点是 ALK 蛋白表达结果可能会是微弱的和局部的11，存在一定主观性 ，对阳性结果须进一步用 FISH 等技术来验证。FISH 采用探针特异性标记细胞核中ALK 断裂点来检测 ALK 重排 ，分离的荧光信号提示存在 ALK 重排。其优点是可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异，假阳性率低。目前与 ALK 融合基因相关靶向药物的实验是以 FISH 作为入组
13、的诊断方法 8。然而 FISH 结果也会受到一些因素的影响，如标本的固定、烤片温度、蛋白质消化不当等都会造成信号减弱或无信号，且价格昂贵造成其不适合成为 EML4-ALK 融合基因的筛查。目前没有检测 EML4ALK 融合基因的金标准，以上方法各有优缺点，有一定的互补性，可结合临床获得的各种生物组织标本，选择最合适的检测方法。3 EML4 一 ALK 阳性患者的临床病理特征 EML4 一 ALK 基因阳性患者与 EGFR 突变患者有相似的临床特征 ，该基因更多发生于男性、不吸烟或轻度吸烟的肺腺癌患者，然而，在大多数情况下，除了极少数例外 12,13，EML4ALK 和表皮生长因子受体基因突变是
14、相互排斥的，同一组织标本,在具有 EGFR 突变临床特征但 EGFR 突变检测为阴性的患者中，约三分之一患者可能携带 EML4ALK 融合基因型。EML4 一 ALK 融合基因多表达于肺腺癌，在腺泡样腺癌 、乳头状癌和印戒细胞癌中尤为多见，其它组织学类型如鳞癌、腺鳞癌、及黏液表皮样癌中也偶见。在亚洲人群中，以腺泡癌为主 14。由此可见 EML4ALK 阳性的 NSCLC 具有独特的分子病理学特征。最新研究提示 EML4 一 ALK 融合基因阳性的 NSCLC 患者可能临床病程较长，预后较好，但尚需更多病例的观察与比较才能确认。 4 EML4 一 ALK 基因与 TKI 耐药性的关系与大多数分子
15、靶向治疗药物一样，克唑替尼（crizotinib）也出现了原发或继发耐药。有研究发现 ALK- TKI 耐药也与 EGFR 介导的旁路途经相关，联合应用 EGFR 与 ALK 抑制剂可能有效治疗这类 NSCLC患者,但缺少大型的临床对照研究。有研究称肿瘤生物学性状的改变是肿瘤发生耐药或进展的常见机制，关于 EGFR 的不同表达影响肿瘤原发及转移的信息已经被报道，但关于 ALK 融合基因的影响仍需进一步研究。Choi 等 15报道1例 EML4ALK 阳性的 NSCLC 患者，男性，28岁，无吸烟史，肺腺癌，在经过 5个月的 crizotinib 治疗后出现了继发耐药，他们对治疗前后的肿瘤基因进
16、行深层测序发现：耐药的产生主要是由于两种独立的突变：一种是融合基因 EML4ALK 第4374位碱基由 A 替代 G，导致位于 ALK 基因第1156位的半胱氨酸替代酪氨酸（C1156Y);另一种是 ALK 基因第4493位碱基由 C 替代 A，导致位于 ALK 基因第1196位的亮氨酸替代甲硫酪氨酸（L1196M).这两种突变可能影响 ALK 蛋白的结构，阻止药物与蛋白结合从而降低药物 crizotinib 的疗效。L1196M 突变通过改变三磷酸腺苷 (ATP)结合位点，阻碍 AIK 基因与药物结合，从而产生耐药，表达 L1196M 突变的细胞要比表达 C1156Y 突变耐药更加明显，对 L1196M 突变的耐药患者，可选择 CH5424802, 可阻断 EML4-ALK L1196M 突变所致
