《小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定作者：罗娜，白云，周静然，宋敏，王艳艳，杨晓亚，许雪青，段文元，熊加祥【关键词】 C56Preparation and functional identification of sublytic complement membrane attack complex on cultured mouse microglia cells【Abstract】 AIM: To establish sublytic membrane attack complex (sMAC) models and identify the sublytic effect
2、s on mouse microglia cells in vitro. METHODS: An activated complex of C56 was generated by treatment of acute phase serum and C7-C9 came from fresh normal human serum to assemble sMAC on cultured microglia cells in vitro. The sublytic dose of sMAC was determined by CCK8 assay. SMAC deposition was id
3、entified by laser confocal microscope (LSCM). The activity of castoff cells and the change of cell focal adhesion were determined by castoff 2counting and Trypan blue staining assay. ELISA was used to detect the change of NO and TNF secretion by sMAC. RESULTS: The sublytic dose of MAC was determined
4、 as C56 1480 and NHS 120. SMAC deposition on microglia cells was seen under a LSCM; The number of castoff microglia cells which had normal cell abilities was greatly increased by sMAC compared to controls (P0.05), SMAC increased NO and TNF secretion in microglia cells after 12 h stimulation (P0.05 v
5、s controls). TNF secretion was significantly increased by activated sMAC compared to inactivated sMAC at different time points (P0.05). CONCLUSION: NO and TNF secretion are increased by sMAC stimulation. SMAC can reduce cell adhension, but not affect cell activity, which suggests that sMAC may have
6、proinflammatory effects on microglia cells.【Keywords】 C56; sublytic MAC; microglia; microscopy, confocal; cell ability; nitric oxide; tumor necrosis factor【摘要】目的： 体外建立小鼠小胶质细胞补体攻膜复合物亚溶破模型，并进行功能鉴定, 探讨补体攻膜复合物( sublytic 3membrane attack complex, sMAC ) 对中枢神经系统小胶质细胞的亚溶破刺激效应. 方法: 分离培养新生小鼠大脑皮层小胶质细胞, 用酵母多糖激
7、活急性期患者血清制备补体优球蛋白 C56，以新鲜正常人血清 ( NHS ) 作为 C7C9 来源，体外组装小鼠小胶质细胞 sMAC 亚溶破模型，CCK8 比色实验确定 sMAC 亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜 ( LSCM )鉴定 sMAC 沉积.脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力. ELISA 法测定 sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNF 分泌量的影响 . 结果： 确定 C56 1480，NHS 120 为小胶质细胞亚溶破补体量；LSCM 显示 sMAC 沉积于小胶质细胞表面； sMAC 刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加 (P0.05 )，而活力正常.
8、刺激后 12 h NO 及 TNF 分泌量比对照组显著增加 (P 0.05 )，不同时相观察 sMAC 刺激后小胶质细胞 TNF 分泌量均显著高于失活 sMAC (P 95%方满足实验要求.1.2.2 补体优球蛋白 C56 的提取及活性鉴定急性期患者血清与 4 g/L 酵母多糖，0.5 mmol/L Mg2+37作用 1 h 后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体 C56 活性，收集活性样品用 0.02 mol/L PB (pH 5.4) 透析，所得优球蛋白沉淀溶于含 100 g/L甘油的 0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 中，即为功能纯 C56 制品.1.2.3CCK8
9、比色实验确定 sMAC 亚溶破剂量将小胶质细胞以 2108 /(L孔)接种于 96 孔培养板，漂洗后，每孔中加入含 1 mmol/L EDTA 无血清 IMDM 养基 100 L,不同释度功能纯 C56 10 L，37 孵育 15 min，再加入 120 NHS，37 孵育 1 h 组装 sMAC. 每孔中加入 10 L CCK8 试剂，37 30 min，于 450 nm 波长处测定 A 值.1.2.4LSCM 鉴定 sMAC 小胶质细胞上的沉积 将 2104 小6胶质细胞接种于自制盖玻片小室，生长至 80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量 C56， 37 15 min；再加入 EDTANHS，冰
10、上孵育 60 min 于细胞表面组装 sMAC. 固定并封闭，加入小鼠抗人 110 sMAC 单克隆抗体，同时设立小鼠抗人 CD3 IgG 同型对照和不加一抗阴性对照，4 过夜；FITC 标记的羊抗小鼠二抗，4 1 h，漂洗后磷酸甘油封片，4 避光保存，48 h 内用 LSCM 观察.1.2.5sMAC 刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC，同浓度 C56，120 EDTANHS，失活sMAC 共 5 组. 将 C56 与 NHS 于 37提前混合孵育 30 min，使sMAC 失活. 各组细胞 37孵育 24 h，收集温育液，离心，加少量培养液重悬，以计数板计算脱
11、落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.1.2.6sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNF 合成的影响细胞分组同前，37孵育 12 h，收集上清，离心后检测各组 NO 与 TNF分泌量.统计学处理： 应用 SPSS 10.0 软件处理，所有数据用 xs表示，组间采用 t 检验和方差分析，P1480 时,sMAC 活性升高，小胶质细胞溶破增多；当 C56 稀释度1480 后, sMAC 活性降低，小胶质细胞溶破减少. 故确立 C56 1480，NHS 120 为小胶质细胞亚溶破补体量.2.2LSCM 鉴定 sMAC 在小胶质细胞表面沉积 以亚溶破剂量C56 及 EDTANHS 体外组装 s
12、MAC，LSCM 观察可见细胞膜表面 sMAC 沉积明显（图 1） ，同时小胶质细胞膜完整性好，形态无明显变化，提示所加入的 sMAC 是亚溶破剂量的 sMAC.图 1 激光共聚焦显微镜鉴定 sMAC 组装 LSCM 200（略）2.3sMAC 刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率亚溶破剂量 sMAC 刺激细胞 24 h 后，细胞脱落增多 (P0.05)；台盼蓝染色见 sMAC 刺激后脱落细胞大多数为存活细胞，其余对照组则大部分为死亡细胞（表 1）.由此推断， sMAC 可降低细胞黏附力，而不影响细胞活力.表 1sMAC 刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率8（略）aP0.05 vs 未刺激组、C56 单独组、EDTANHS 组和失活 sMAC 组. 2.4 亚溶破 sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNF 合成的影响 5 组小胶质细胞 37孵育 12 h 后 ELISA 检测上清中 NO 与 TNF 分泌量. sMAC 刺激后小胶质细胞分泌 NO 与 TNF 显著增高，同各对照组相差显著(P0.05 ，图 2）.aP0.05 vs 未刺激组、C56 单独组、EDTANHS 组和失活sMAC 组. 图 2sMAC 对小胶质细胞分泌炎性因子 NO 与 TNF 的影响
