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1、硕 士学位 论 文利用噬菌体展示技术制备全人抗 DR5 scFv 抗体学 科 、 专 业 ： 基 础 医 学 、 免 疫 学研 究 方 向 ： 抗 体 工 程申 请 学 位 类 别 ： 医 学 硕 士申 请 人 ： 韩 迎 莉指 导 教 师 ： 马 远 方 教 授刘 峰 涛 副 教 授二 一 三 年 五 月单位代码 10475学 号 104753101202分 类 号 R392Preparation of Anti-Human DR5 Single ChainVariable Fragment Antibodyby Phage Surface Display TechniqueA Disser
2、tation Submitted tothe Graduate School of Henan Universityin Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree ofMaster of MedicineByYingli HanSupervisor: A.P. Yuanfang MaFengtao LiuMay, 2013IV3摘 要背 景 DR5 是 肿 瘤 坏 死 因 子 TNF 相 关 的 凋 亡 诱 导 的 配 体 （ TNF-relatedapoptosis inducing ligand， TRAIL ） 的 一 个
3、 受 体 ， 通 过 它 ， TRAIL 能 诱 导 细 胞 发 生凋 亡 。 本 实 验 室 利 用 DR5 抗 原 制 备 出 能 分 泌 抗 DR5 的 杂 交 瘤 细 胞 。 该 抗 体 为 鼠 单 克 隆 抗 体 ，但 存 在 一 些 不 足 之 处 ， 妨 限 制 了 其 在 临 床 上 的 应 用 。 随 着 基 因 工 程 技 术 的 发 展 ， 利 用 基因 工 程 技 术 制 备 出 全 人 抗 体 ， 不 仅 克 服 了 鼠 源 性 的 弊 端 ， 鼠 单 抗 特 异 性 强 、 均 一 性 强 的优点也被保留了下来。其中，全人抗体和人源化抗体的制备技术包括了以下三个方面
4、：嵌 合 抗 体 、 CDR 移 植 的 抗 体 和 展 示 技 术 与 转 基 因 技 术 制 备 的 抗 体 ， 其 中 以 噬 菌 体 展 示 技术 可 以 制 备 全 人 抗 体 ， 从 根 本 上 克 服 了 HAMA（ human anti-mouse antibody）反应，因此，噬 菌 体 抗 体 库 技 术 属 于 最 理 想 的 制 备 全 人 抗 体 人 方 式 。目 的 通 过 利 用 噬 菌 体 展 示 技 术 来 建 立 天 然 噬 菌 体 抗 体 库 ， 并 从 中 筛 选 、 制 备 全人 源 化 抗 体 。方 法 应 用 RT-PCR 技术从人外周血淋巴细胞中
5、获取人抗体可变区基因 VH、 VL，用 重 叠 延 伸 PCR 技 术 把 连 接 肽 基 因 （ Gly4Ser） 与 VH 和 VL 连接成单链抗体 scFv， 利 用 SfiI和 Not 酶 切 位 点 ， 将 scFV 基因连接入表达载体 pcantab-5E 中 ， 电 转 化 入 大 肠 杆 菌 E.coilX-Blue 中 ， 利 用 噬 菌 体 感 染 ， 建 立 初 级 噬 菌 体 抗 体 库 。 利 用 菌 液 PCR 来 鉴 定 所 建 立 噬 菌体 抗 体 库 的 插 入 率 ， 挑 取 阳 性 克 隆 送 北 京 金 唯 智 生 物 技 术 公 司 测 序 ， 并 经
6、NCBI-Blast-Ig-Blast， 来 鉴 定 噬 菌 体 抗 体 库 的 多 样 性 。 利 用 固 相 筛 选 对 所 建 立 的 初 级 噬菌 体 抗 体 库 进 行 四 轮 富 集 浓 缩 ， 通 过 ELISA 筛选出抗 DR5 的 scFV 段阳性克隆。结 果 成 功 的 构 建 了 库 容 量 为 1.01107 的 天 然 噬 菌 体 抗 体 库 ， 经 测 序 比 对 后 多样 性 良 好 ， 并 从 中 筛 选 出 一 株 表 达 频 率 较 高 的 克 隆 ， 和 4 株 与 抗 TNF- 抗 体 高 度 同 源 的克 隆 。结 论 成 功 的 筛 选 出 多 株
7、全 人 抗 DR5 抗 体 scFv， 为 抗 体 蛋 白 的 获 得 打 下 了 良 好 地基 础 。 并 建 立 起 了 一 个 天 然 全 人 抗 体 库 的 技 术 平 台 ， 为 以 后 筛 选 针 对 各 种 毒 素 、 病 毒 、I病 原 菌 等 的 相 关 抗 原 的 抗 体 和 获 得 特 异 性 人 源 化 抗 体 类 药 物 奠 定 了 基 础 。关键词：噬菌体展示技术，天然噬菌体抗体库，全人抗体，D R5IIABSTRACTBackgrandDR5 is one of tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis induc
8、ing ligand (TRAIL)s receptors.Thisapoptotic effect is mediated by interaction of TRAIL and its receptors. Our laboratory have prepared thehybridoma named YM366EC, which can secrete anti-DR5 antibody. It can cause human anti-mouseantibody reaction because it is a murine monoclonal antibody. With the
9、development of genetic engineeringtechnology, we have prepared the humanized and full human antibody can be prepared. Through thistechnology, we not only overcomed the disadvantage of the murine antibody, but also preserved specificityand homogeneity of the murine antibody, The preparation technolog
10、y of gene engineering antibodyincludes the following three aspects: chimeric antibody, CDR transplantation antibody, antibody preparedby display technique and transgenic technique. The HAMA reaction has been overcomed because thedisplay technique can prepared full human antibody. So, phage display t
11、echnique is the optimal methods tothe prepartion of full human antibody.ObjectiveTo establish a phage antibody library by phage display technology and screen he full human antibodywhich anti-DR5.MethodsVH and VL of human antibody were obtained by RT-PCR. Peptide gene ( Gly4Ser )3.connectedVH/VL into
12、 a single chain antibody scFv through overlap extension PCR. Then, scFV gene was clonedinto the expression vector pcantab-5E using restriction enzyme SfiI and Not . They were electroporatIIIinto escherichia coli X-Blue. The primary phage antibody library was established after phage infection. Toiden
13、tify the insertion rate of the antibody library, we use the bacterium liquid PCR. We sequenced thepositive clones and analized the diversity of the phage antibody library . The anti-DR5 positive clonesscFv were picked up from the primary phage antibody library after four rounds of enriched by ELISAm
14、ethod.ResultsWe have successfully constructed a natural phage antibody library of 1.01107 , which have a gooddiversity. Finelly, We find that 12 clones is the same in 30 clones, and 4 clones are highly homologous toanti-TNF- antibody.ConclusionsWe have screened out several strains which highly expes
15、s scFv segment of the full human anti-DR5antibody,and make a good basis for the preparation of target protein. We have established a natural fullhuman antibody library technology platform, which lay the foundation for future screening other fullhuman antibody which anti toxins, viruses, bacteria and
16、 obtain specific full human antibody drugs.Keywords: phage display technology, natural phage antibody library, the full human antibody, DR5IV缩略词表中 文 译 名 英 文 缩 写 英 文 全 称吸 光 值 A absorbance氨 苄 青 霉 素 Amp ampicillin封 闭 液 BB blocking buffer碱 基 对 bp base pairs牛 血 清 白 蛋 白 BSA bovine serum album互 补 DNA cDNA complementary DNA互 补 决 定 区 CDR complementary determinant region天 d day二 乙 基 焦 碳 酸 盐 DEPC diet
