第7章微生物的生长

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1、第七章 微生物的生长,第一节 微生物纯培养的生长第二节 外界因素对微生物的影响,生长:细胞原生质量不断增加，体积得以增大。 繁殖:个体数目增加 在单细胞微生物中，细菌分裂的结果，是为繁殖；在多细胞微生物中，细胞数目的增加如不伴随个体数目的增加时，只能算是生长。条件适合的情况下，生长和繁殖始终是交替进行的。,微生物生长的概念：,1、稀释法幻灯片 4 2、划线法幻灯片 5 3、单细胞挑取法 4、利用选择培养基分离法幻灯片 7,第一节 微生物纯培养的生长,一、纯培养分离法,微生物学中将从一个细胞得到的后代称为纯培养。,第一节 幻灯片 12,划线法（一）,划线法（二） 第一节,选择培养基应用技术,沙门

2、氏菌选择性显色培养基,适合嗜水气单胞菌生长的RS培养基,适合弧菌生长的TCBS培养基,微生物生长的测定是依据群体的增长量。方法有： （一）直接计数法设 备简单，可迅速得到结果，还可观察细菌的形态特征。但不能区分死菌和活菌结果为总菌数。 1.涂片染色法幻灯片 9 2.计数器测定法幻灯片 10 3.比例计数法幻灯片 11 4.电子自动计数器法,二、生长测定,a,b,d,细菌总数(个/ml)S长方形S圆形细菌平均数100二、生长测定,0.01ml,计算细菌总数的快速测试纸,计算大肠杆菌群总数的快速测试纸二、生长测定,10ml血液10ml菌液,混匀,0.01ml涂抹，计数。血细胞:菌1 : 3,细菌总

3、数(个/ml)血球数(个/ml) 3 100二、生长测定,(二) 间接记数法 基于细菌在培养基中有生长繁殖的能力，因而测定的是活菌数，数值比直接记数法测定的要小。幻灯片 4 1.平皿菌落记数法幻灯片 4 误差： 并非所有生活细菌都可在实验条件下及实验期间生长、形成菌落。 细菌聚集成团，菌落则由几个或更多细菌形成。 有些细菌在操作时遭到破坏。 2.薄膜过滤计数法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。,1.比浊法测定细菌悬液浓度 浊度计、光电比色计等都可用来细菌悬液浓度。 2.细菌总含氮量法确定细菌浓

4、度 3.细胞干重法,(三)测定细胞或原生质总量计数法,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。,比浊法,光电比色计,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量愈多或生长愈旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,4.生理指标法,如果以细胞增长数的对数值或增长速度为纵坐标，以培养时间为横坐标作图，可得到一繁殖曲线。对单细胞细菌而言，它们的繁殖就是群体生长，所以又称为生长曲线。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础。,三、

5、生长曲线,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图。,细菌的生长曲线,生长曲线可分为几个阶段：,1.延迟期 特点：细胞体积增加快，细胞代谢活力强，细胞中RNA含量高，嗜碱性强，对不良环境条件敏感。 原因：适应新的环境而出现的调整代谢的时期。 延迟期的长短：与菌种遗传、菌龄及移种至新鲜培养基前后所处的环境是否相同等因素关。,2.对数生长期 在此期中，细胞数按几何级数增加122n，n为分裂次数或增殖代数，其间隔时间称为代时(G)，即每增加一代所需要的时间，可用下式表示： Gt2t1n t2t1 3.3（lgx2lgx1）利用此公式可计算出群体生长世代。,例：t0时每毫升菌液中细胞数为104，4h

6、后细胞数增加到108，此条件的代时为：G t2t1 3.3( lgx2lgx1 ) 4 3.3（8 4） 4 3.34 0.3（h）n（lgx2lgx1）lg2 3.3（84） 0.34 13.2(代),1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短 3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比， 4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。 凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。,影响微生物增代时间（代时）的因素：,特点： 生长速度高，群体中的细胞化学组成即形态、生理特征比较一致。 3.稳定

7、期 新增殖的细胞数与死亡细胞数趋于平衡，活菌数保持相对稳定。 特点：开始积累储存物质，形成芽胞。此期可开始收获。 生产上常通过补充营养物质或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。,原因：有害代谢产物积累以及其他环境条件如pH、氧化还原电位等的变化对细菌生长不利。 长短：稳定期时间长短取决于菌种及环境条件。 4.衰亡期 细菌死亡率逐渐增加，以至细胞死亡数超过新生数，活菌数明显下降。 特点：细胞常出现多形态，包括畸形和衰退型，细胞死亡伴随着自溶。,将微生物置于一恒定容积的培养基中培养，最后一次收获，称为分批培养

8、。人们设想：只要培养液的流动量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量不变。50年代据此而设计的连续培养技术叫连续培养法。,四、连续培养,三、连续培养,将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,分批培养（batch culture）or封闭培养（closed culture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,连续培养(Continous culture ）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。

9、,连续培养装置示意图A.恒浊培养系统B.恒化培养系统1.盛无菌培养基的容器2.控制流速阀3.培养室4.排出管5.光源6.光电池,恒化连续培养,同步培养：使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。 同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。,五、同步生长,1.选择法 选择法的优点是在不影响细菌代谢的情况下得到同步培养，菌体生命活动较为正常。 2.诱导法 诱导同步生长的环境条件往往是可以使细菌继续生长，但特异性抑制细菌分裂，移去该抑制条件后细菌就同时出现分裂。 3.抑制DNA合成法,获得同步生长的方法：,蔗

10、糖梯度不同步菌群体小细胞沉淀慢收集各部分小细胞培养,不同步的细胞过虑翻转滤膜倒人培养基新分裂的细胞被洗脱收集段时期内的洗脱液,根据对微生物限制程度的不同，有以下三种 1.防腐或抑菌 阻止或抑制微生物的生长和繁殖。用于防腐的药品称防腐剂或抑菌剂。 2.消毒或杀菌 杀死物体中的病原微生物。用于消毒的化学药品叫消毒剂或杀菌剂。 3.灭菌 杀死物体中所有微生物。 无菌法即防止任何微生物进入目标物体的方法。抗菌即抑菌和杀菌的总称。,第二节 外界因素对微生物的影响,理化因子抑菌还是杀菌作用的相关因素：,理化因子的强度或浓度；同一浓度理化因子作用时间的长短；不同种类的微生物；同种微生物的不同生长时期；,杀灭

11、或抑制微生物的物理因素,温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波等,（一）温度1.温度类群 根据微生物生长、繁殖需要的温度可将其划分为： 最低温度 最适温度 最高温度( )低温微生物（嗜冷菌）510 1020 2530中温微生物（嗜温菌） 1020 18284045高温微生物（嗜热菌） 2540 5060 7085,一、物理因素(温度、干燥、渗透压、光线、射线、滤过等),2.高温对微生物的影响 微生物对高温比较敏感，所以用高温灭菌是常用的物理方法。不同的微生物对高温的敏感性不同，多数细菌、酵母、真菌的营养细胞和病毒5065，10分钟死亡；腐生的嗜热芽孢杆菌抗热性很强一般120,12分钟死亡；细菌的芽胞

12、抗热性最强，100以上要十多小时才致死（140，23小时）。,3.高温灭菌法 干热灭菌法 火焰灭菌 热空气灭菌 160 ，23小时。 注意： 温度不宜超过170；包装不宜过厚；排列不能过挤；灭菌过程中严禁开门。 湿热灭菌 煮沸 100 ，15分钟以上。 高压蒸汽灭菌法 通常是15磅，20分钟。,多数细菌和真菌的营养细胞：在60左右处理5-10分钟； 酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理； 细菌的芽孢：121处理15分钟以上；,湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：,高压蒸汽灭菌法是湿热灭菌中效果最好的一种。因为：更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构； 蛋白质的凝固变性与其含水量有

13、关。含水量越高其凝固所需温度就越低。 蒸汽的穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固。 蒸汽与被灭菌物体接触凝成水时，可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效果。 使用时注意： 加热加压至23磅后缓缓放气至压力为0，再加热加压至要求。因为高压蒸汽灭菌不是压力的作用，而是由于蒸汽的高温致死作用。,高压灭菌锅中的空气和蒸气混合时的温度,间歇灭菌法 常压,100,1530min，室温过夜，使芽胞萌发，反复2次。 巴斯德消毒法 用于牛奶、啤酒和葡萄酒等。 低温长时间 6365 ，30分钟 高温短时间 7172 ，15分钟 加热后应迅速冷却至10以下，称为冷击法，可进一步促使细胞死亡。此法基于结核杆菌的致死温度

14、为62 ，15分钟而定。布氏杆菌、沙门氏菌等减少90%以上。,4.低温对微生物的影响 生长繁殖停滞，但仍能存活。 （二）干燥 微生物失去水分不仅代谢发生障碍，严重时会导致死亡（盐度升高）。 （三）渗透压 高渗 微生物质壁分离（生理干燥）； 低渗 胞膜破裂或胞浆压出。 （四）光线 直射日光有强烈的杀菌作用。,光感作用：可见光具微弱的杀菌作用，若将某些染料加到培养基中，则可见光的杀菌作用增强。 紫外线 波长20003200埃部分具有杀菌作用，但穿透力差。（杀菌原理） 光复活效应：经紫外线杀死的菌体，用可见光照射后，有的还能活过来，这种现象称光复活效应。主要是一种以可见光为能源的酶可以劈开二聚物，使DNA复制恢复正常。,