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1、陕 西 中 医 学 院硕 士 学 位 论 文中 药 抗 疏 健 骨 颗 粒 对 OP 模 型 大 鼠 骨 密 度 骨 组 织 形 态 学 、 生 物 力学 的 影 响姓 名 ： 樊 晓 晨申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 中 医 骨 伤 科 学指 导 教 师 ： 史 传 道2011-04摘 要目的 本 实 验 旨 在 通 过 用 抗 疏 健 骨 颗 粒 治 疗 OP 模 型 大 鼠 ， 观 测 骨 密 度 （ BMD） 、骨 生 物 力 学 性 能 、 骨 组 织 形 态 学 指 标 的 变 化 ， 来 证 实 抗 疏 健 骨 颗 粒 对 OP 模 型 大 鼠 的疗 效 ， 探 讨
2、 抗 疏 健 骨 颗 粒 预 防 和 治 疗 骨 质 疏 松 症 的 作 用 机 理 。 为 中 医 药 防 治 骨 质 疏 松症 打 下 良 好 的 理 论 和 实 验 基 础 。方法 60 只 6 月龄雌性 SD 大鼠随机分为假手术组，模型组，乙烯雌酚组，抗疏健 骨 颗 粒 大 、 中 、 小 剂 量 组 ， 每 组 各 10 只 。 假 手 术 组 摘 除 卵 巢 旁 的 大 致 相 同 大 小 脂肪 ， 其 余 5 组 以 双 侧 卵 巢 切 除 法 复 制 骨 质 疏 松 模 型 ； 12 周 后 全 部 处 死 ， 观 测 骨 密 度（ BMD） 、 骨 组 织 形 态 学 指 标
3、 、 骨 生 物 力 学 性 能 的 变 化 。结果 1.大 鼠 造 模 12 周 后 ， 腰 椎 和 股 骨 远 端 骨 密 度 （ BMD） 模 型 组 明 显 低 于 假 手术 对 照 组 （ P0.05)， 弯 曲 能 量 显 著 性 增 高 (P0.05)。3. 大 鼠 造 模 12 周 后 ， 骨 组 织 形 态 学 指 标 测 定 ， 与 假 手 术 组 比 较 ， 模 型 组 骨 形 态计量学显示 TBV%显著下降，T RS%、 TFS%和 MAR 均明显升高， OSW 和 mAR 显著升高(P 0.05), bending energy significantly incre
4、ased (P 0.05).3.Rats after 12 weeks of modeling, determination of morphologicalcharacteristics of bone tissue, compared with the sham group, model group,histomorphometry showed a significant decline in TBV%, TRS%, TFS%, and MARwere significantly increased, OSW, and mAR significantly increased (P 0.0
5、5中药抗疏健骨颗粒对 OP 模型大鼠骨密度、骨组织形态学、生物力学影响的实验研究表 1：大鼠腰椎、股骨远端骨密度数据2 2假 手 术 组 9 0.3210.0240 0.32280.0056模 型 组 10 0.21110.0230 0.21430.0058乙 烯 雌 酚 组 9 0.31410.0414 0.31000.0052抗 疏 健 骨 颗 粒 大 剂 量 组 10 0.29560.0431抗 疏 健 骨 颗 粒 中 剂 量 组 10 0.26690.0101抗 疏 健 骨 颗 粒 小 剂 量 组 10 0.23370.01140.27730.00780.27730.00780.217
6、50.0073 第 二 部 分 ： 抗 疏 健 骨 颗 粒 对 骨 质 疏 松 模 型 大 鼠 骨 组 织 形 态 学 改 变 的 影 响1.材料1.1 实 验 动 物 ： （ 同 第 一 部 分 ）1.2 主 要 试 剂试 剂 名 称 规 格 生 产 厂 家 或 提 供 实 验 室甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 500ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯 500ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所甲 苯 胺 蓝 50g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所二 甲 苯 500ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所枸 橼 酸 500g 第 四 军 医 大 学 骨
7、 研 所磷 酸 氢 二 钠 500g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所硫 酸 钾 500g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所无 水 乙 醇 500ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所明 胶 500g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所氢 氧 化 钠 500g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所无 水 氯 化 钙 500g 第 四 军 医 大 学 骨 研 所四 环 素 5ml 北 京 天 根 生 物 有 限 公 司硝 酸 银 溶 液 100ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所5%硫 代 硫 化 钠 水 100ml 第 四 军 医 大 学 骨 研 所5中药抗疏健骨颗粒对 OP 模型大鼠
8、骨密度、骨组织形态学、生物力学影响的实验研究1.3 主 要 仪 器仪 器 名 称 规 格 型 号 生 产 厂 家电 动 搅 拌 机 99 1 金 坛 市 富 化 仪 器 有 限 公 司LEICA DMLA 显 微 镜 德 国 Leica 公 司Leiea Q-Win Stander V2.3全 自 动 图 像 分 析 系 统 德 国 Leica 公 司普 通 冰 箱 第 四 军 医 大 学 骨 研 所电 热 恒 温 培 养 箱 第 四 军 医 大 学 骨 研 所电 子 天 平 第 四 军 医 大 学 骨 研 所分 液 漏 斗 第 四 军 医 大 学 骨 研 所2.方法2.1 实 验 动 物 分
9、 组 (同 第 一 部 分 )2.2 实 验 动 物 模 型 （ 同 第 一 部 分 ）2.3 实 验 动 物 给 药 （ 同 第 一 部 分 ）2.4 骨 组 织 形 态 学 标 本 采 集每 组 动 物 处 死 前 进 行 四 环 素 标 记 ， 30mg/Kg.d。 首 次 给 药 在 处 死 前 第 14 天 ， 第 二次 在 处 死 前 第 5 天 。 喂 养 至 12 周 后 ， 用 10%水 合 氯 醛 400mg/Kg， 腹 腔 注 射 ， 麻 醉 生效 后 ， 取 下 右 侧 胫 骨 中 上 段 ， 将 周 围 然 组 织 剔 除 干 净 ， 立 即 放 入 80%酒 精 中
10、 固 定 。2.5 不 脱 钙 骨 标 本 的 制 作 2 固 定 ： 标 本 采 取 后 立 即 固 定 于 80%酒 精 中 ， 保 存 于 4 冰 箱 中 。 这 样 兼 顾 了 固定 和 脱 水 ， 固 定 72 小 时 。 脱 水 ： 固 定 后 用 95%、 100%乙 醇 系 列 脱 水 各 2 次 ， 每 次 24 小 时 。 修 整 标 本 ： 将 胫 骨 标 本 用 修 整 为 1cm 左 右 骨 块 ， 将 胫 骨 上 端 打 磨 平 整 ， 保 证 能够 直 立 于 包 埋 瓶 中 。 透 明 ： 于 二 甲 苯 中 透 明 24 小 时 。渗透：首先配制渗透液。M M
11、A液（甲基丙烯酸甲酯液）甲基丙烯酸甲酯75%， 邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯 25%。 混 匀 后 持 续 搅 拌 30min； MMA 液 （ 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 液 ） 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 （ 用 5%氢 氧 化 钠 洗 去 抗 聚 合 剂 ） 75%， 邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯 25%，过 氧 化 苯 甲 酰 1g/100ml。 混 合 后 持 续 搅 拌 4 小 时 ； MMA 液 （ 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 液 ）甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 （ 用 5%氢 氧 化 钠 洗 去 抗 聚 合 剂 ） 75%， 邻 苯 二 甲 酸 二 丁 酯 25%， 过62.
12、7 骨 组 织 形 态 学 指 标 检 测 ： 用 Leica DMLA 型 显 微 镜 ， 按 照 章 明 放 等 人 的 方 法 ，中药抗疏健骨颗粒对 OP 模型大鼠骨密度、骨组织形态学、生物力学影响的实验研究氧 化 苯 甲 酰 2.5g/100ml。 混 合 后 持 续 搅 拌 4 小 时 。 MMA 液 为 最 后 包 埋 剂 ， 新 鲜 配 制者 最 好 。 将 透 明 过 的 标 本 依 次 放 入 液 、 液 、 液 进 行 渗 透 ， 每 次 48 小 时 。 包 埋 ： 在 适 中 的 包 埋 器 中 ， 将 骨 标 本 浸 入 新 鲜 配 制 的 包 埋 液 中 ， 需 做
13、 切 片 的 部分 放 于 底 部 。 将 包 埋 器 放 入 40 恒 温 箱 中 12 小 时 ， 然 后 置 于 室 温 下 直 至 包 埋 液 硬 化 ，后 放 于 4 冰 箱 保 存 ， 切 片 时 打 碎 包 埋 瓶 ， 取 出 包 埋 块 。2.6 制 作 不 脱 钙 骨 切 片 2 配 置 贴 片 液 ： 明 胶 4.5g， 蒸 馏 水 1000ml， 在 75 下 溶 解 。 取 100ml 加 入 4硫 酸 钾 3.8ml 即 为 贴 片 液 。切片：将修整后包埋标本块放于重型切片机的标本夹上固定。切片时用 30酒 精 湿 润 刀 面 及 组 织 切 面 。 切 10um
14、切 片 以 观 察 细 胞 结 构 ， 用 转 轮 式 切 片 机 切 制15-20um 切 片 ， 于 荧 光 下 测 量 四 环 素 标 记 的 数 据 。 将 玻 片 于 50 的 贴 片 液 中 浸 数 分 钟 ，然 后 于 50 恒 温 箱 中 烘 干 。 在 处 理 过 的 载 玻 片 上 滴 数 滴 95 酒 精 ， 放 上 切 片 ， 用 眼科 镊 小 心 展 开 ， 覆 以 一 张 薄 纸 ， 压 紧 切 片 ， 用 夹 子 夹 紧 放 置 于 37 恒 温 箱 中 烘 干 。 甲 苯 胺 蓝 染 色 切 片 依 次 入 液 、 液 进 行 脱 塑 ， 各 10min。 下
15、行 酒 精 ： 依 次 入 无 水 酒 精 、 95 酒 精 、 90 酒 精 、 80 酒 精 、 70 酒精 ， 每 级 2min。 蒸 馏 水 浸 洗 5min。 甲 苯 胺 蓝 液 中 染 色 30min。 缓 冲 液 中 冲 洗 2 次 ， 每 次 1min。 用 滤 纸 洗 干 切 片 ， 入 无 水 酒 精 脱 水 2 次 ， 每 次 1min。 二 甲 苯 透 明 2 次 ， 每 次 1min。 常 温 下 凉 干 切 片 ， 用 贴 片 液 进 行 封 固 。4.Von、 Kossa 法 染 色 3 切 片 脱 塑 后 蒸 馏 水 洗 。 浸 于 1.5%硝 酸 银 溶 液
16、。 蒸 馏 水 洗 ， 浸 入 5%硫 代 硫 化 钠 水 溶 液 2min。 充 分 水 洗 、 蒸 馏 水 洗 后 入 1%中 性 红 复 染 1min。 乙 醇 脱 水 ， 二 甲 苯 透 明 、 封 固 。4测 量 距 髓 板 下 1mm 处 至 远 端 4mm 范 围 内 的 骨 组 织 参 数 。7中药抗疏健骨颗粒对 OP 模型大鼠骨密度、骨组织形态学、生物力学影响的实验研究2.7.1 检 测 项 目 骨 小 梁 体 积 百 分 比 (TBV%)： 骨 小 梁 体 积 /被 测 骨 髓 腔 总 体 积 100%。 是 骨 量 水平 主 要 标 志 。 骨 小 梁 吸 收 表 面 百 分 比 (TR
