作业1不同炮制工艺对女贞子中齐墩果酸类成分影响

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1、1正交设计优选盐蒸女贞子的最佳炮制工艺赵金凤 （河南中医学院 河南郑州 09 中药制药 2009127057）【摘要】目的:优选盐蒸女贞子的最佳炮制工艺和方法。方法 :以特女贞子苷和红景天苷为评价指标以盐用量、水用量、闷润时间和蒸制时间为考察因素,采用正交试验设计 L9(44)表安排实验 ,综合评判,优选女贞子的盐蒸工艺。结果 :优选出的盐蒸女贞子最佳炮制工艺为:取净女贞子,1kg 样品加 6g 的盐,加 100g 水,闷润 1 h,蒸汽加热蒸制 1 h。结论:优选出的盐蒸女贞子炮制工艺合理可行。【关键词】女贞子;正交试验；盐蒸工艺；特女贞苷和红景天苷 女贞子系木犀科女贞 Ligustrum

2、lucidumAit1 的干燥成熟果实,具滋补肝肾,明目乌发功能。用于眩晕耳鸣,腰膝酸软,须发早白,目暗不明1。成分研究表明，女贞子主含萜类（三萜类脂溶性成分和环烯醚萜苷类水溶性成分） 、黄酮类成分。女贞子中的三萜类脂溶性成分有齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸、乙酰熊果酸等，环烯醚萜苷类水溶性成分有特女贞苷、女贞苷、10-羟基女贞苷、红景天苷、异女贞苷、新女贞子苷等，黄酮类成分有芸香苷、槲皮素、芹菜素等。女贞子中尚含多糖、挥发油、脂肪油、氨基酸、无机元素等。齐墩果酸具有抗炎、增强免疫、降血脂、护肝等作用。熊果酸具有安定、降温、降低血清转氨酶作用。女贞子多糖具有免疫增强作用。红景天苷及其苷元（酪醇

3、）具有抗衰老、抗寒冷等作用。甘露醇具有缓泻作用。历史上女贞子的炮制方法很多2, 3,现代对女贞子的炮制研究主要以齐墩果酸、甘露醇、红景天苷、酪醇和多糖等为成分指标，以抗炎、降血糖、护肝、免疫作用等为药理指标，对女贞子的炮制意义、炮制工艺及饮片质量进行的初步研究。现代各地女贞子的炮制方法主要有清蒸、酒蒸、酒炖、醋蒸、盐蒸、盐炒,但尚缺乏客观的工艺技术参数和科学的饮片质量标准。目前对女贞子的炮制工艺研究,多以特征性不强的脂溶性成分齐墩果酸和熊果酸含量为评价指标,而对环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类等水溶性活性成分在炮制过程中的变化关注较少,尚不能客观确切地反映女贞子炮制前后的本质变化。本研究以特女贞苷和红

4、景天苷含量为评价指标,以盐用量，水用量，闷润时间和蒸制时间为考察因素,采用正交试验设计,综合评判,优选女贞子的炮制工艺和方法。1.仪器和试药111 仪器 Agilent1100 高效液相色谱仪(含 DAD 二极管阵列检测器,美国Agilent 公司); JA2003N 型电子天平(感量 0. 001 g,上海科技仪器公司); FA1604N型电子天平(感量 0. 000 1 g,上海精密科学仪器有限公司); KQ-250E 型医用超声波清洗器(功率 250W,频率 40 kHz,江苏昆山市超声仪器有限公司);电磁炉(南海市富士宝家用电器有限公司)。112 试药 女贞子(购自郑州市张仲景大药房

5、),经河南中医药大学药学院炮制学科带头人张振凌教授鉴定为木犀科植物女贞 Ligustrum lucidumAit1 的干燥成熟果实;红景天苷对照品(中国药品生物制品检定所 ,供含量测定用,批号为2110818-201204);特女贞苷对照品 (中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号为 110818-201215 );食用盐（） ；高效液相用乙腈、甲醇(色谱纯);其余试剂均为A.R。2 方法与结果2. 1 正交试验设计 根据中国药典及各省、市中药炮制规范,酒炖女贞子,一般每 1kg 净女贞子用食盐 6-7g;水 100-250g;闷润时间一般为 02 h;蒸制时间一般为 1 h,个别地区为

6、1.5-2 h4。实际调查发现,生产中是取女贞子药材,用清水快速洗净,加盐水拌匀,蒸制。故本实验选取食盐用量、水用量、闷润时间和蒸制时间作为考察因素,每个因素安排 4 个水平,选用 L9(44)正交表安排实验,具体安排见表 1,正交试验安排见表 2。表 1 因素与水平表因素水平 食盐用量/g 水用量/g 闷润时间/h 蒸制时间/hA B C D1 6 100 0.5 0.52 6.5 150 1 13 7 200 1.5 1.54 7.5 250 2 22. 2 样品的制备 取净女贞子 100 g,平行 9 份,按表 2 的工艺组合进行炮制。具体操作方法如下:取净女贞子 100g,取食盐用适量

7、水融化 ,闷润,密封,放入锅屉上,用蒸汽加热蒸制规定时间,取出,放凉,烘箱中 50C 烘干,取出放凉,塑料袋密封,即得 19 号样品。2. 3 水分含量测定 取各样品粉末(过 2 号筛)2. 5 g,精密称定,按中国药典2010 年版一部附录 H 水分测定法(烘干法)测定,结果水分含量在 4. 83% 7. 12%。按干燥品计算样品中各指标成分的含量。2. 4 红景天苷含量测定 52. 4. 1 色谱条件 色谱柱:KromasilC18 柱(5um,4. 6 mm200 mm);检测波长: 224 nm;柱温: 30C;流动相:乙腈-水(7B93);流速: 1. 0 mL/min。2. 4.

8、2 供试品溶液的制备 取各样品粉末(过 3 号筛)约 0. 2 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入 30%乙醇 20 mL,密塞,摇匀,称定重量,超声处理 30min,取出,放冷,再称定重量,用 30%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液即得。2.4. 3 对照品溶液的制备 精密称取红景天苷对照品 2. 51 mg,置 5 mL 量瓶中,加 30%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。2.4. 4 线性关系考察 精密吸取红景天苷对照品溶液 0. 01、0. 02、0. 05、0. 31、0. 2、1 mL,置 1 mL 棕色量瓶中,分别加 30%乙醇定容至刻度,摇匀。各取20uL 注入液相色谱

9、仪,按上述色谱条件测定峰面积。以进样量 (X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,结果红景天苷在 0. 104ug10. 04ug 范围内与峰面积具有良好的线性关系,回归方程为 Y=2 397. 9X-82. 639,r=0. 999 9。2.4. 5 样品含量测定 分别精密吸取红景天苷对照品溶液与供试品溶液各20LL,注入液相色谱仪,测定峰面积,记录色谱图和结果。2. 5 特女贞苷含量测定 62. 5. 1 色谱条件 色谱柱:KromasilC18 柱(5um,4. 6 mm200 mm);检测波长: 224 nm;柱温: 25C;流动相:乙腈-水(20B80);流速: 1.

10、0 mL/min。2. 5. 2 供试品溶液的制备 取各样品粉末( 过 3 号筛 )约 0. 1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入 50%乙醇 50 mL,称定重量,加热回流 1 h,取出,放冷,再称定重量。用 50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.5. 3 对照品溶液的制备 精密称取特女贞苷对照品 4. 20 mg,置 10 mL 棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。2.5. 4 线性关系考察 精密吸取特女贞苷对照品溶液 0. 01、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1 mL,置 1 mL 棕色量瓶中,分别加甲醇至刻度 ,摇匀,各取 20

11、uL 进样,按上述色谱条件测定峰面积,以进样量(X)为横坐标 ,峰面积(Y) 为纵坐标,绘制标准曲线,结果特女贞苷在 0. 084ug8. 4ug 范围内与峰面积具有良好的线性关系。回归方程为 Y=806. 97X-29. 264,r=0. 999 6。2.5. 5 样品含量测定 分别精密吸取特女贞苷对照品溶液与各样品溶液 20LL,注入液相色谱仪,测定,记录色谱图和结果。表 2 正交试验安排及结果(n=3)试验号 因 素 红景天苷 特女贞苷 综合评分A B C D4123456789K1K2K3R2. 6 最佳炮制工艺方案的优选根据各指标成分在工艺选择中的主次地位,给予不同的加权系数,求出综

12、合质量评分 Y,Y=(各样品中红景天苷含量 9 个样品中红景天苷最高含量)60+( 各样品中特女贞苷含量9 个样品中特女贞苷最高含量)40。以综合评价值对实验结果进行直观分析和方差分析,结果见表 2。由表 2 直观分析表明,盐蒸女贞子的最佳炮制工艺条件为 A3B2C1D3。各因素影响主次顺序为 DCBA。由表 3 可以看出,因素 A 对盐蒸女贞子饮片质量影响最小,故选择 A 列作为误差列。由表 3 方差分析结果表明 ,因素 D 对酒女贞子质量有显著性影响,而因素 A、B、C 对实验结果均无显著影响。由于因素 A、B对实验结果均无显著影响,从节省辅料,简化操作考虑,可选 A1、B1 。曾对 1k

13、g 女贞子加 6g 食盐 100ml 水和 6g 食盐 150ml 水的两种盐蒸品中齐墩果酸含量进行测定比较，结果其含量分别为 0. 812%和 0. 752%.。综合考虑以上因素,最终确定盐蒸女贞子的最佳炮制工艺为 A1B1C1D3,即取净女贞子 100kg,加食盐 6kg,不加水,闷润 0.5 h,蒸汽加热炖制 1.5 h。表 3 方差分析表方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F 值 显著性 BCD误差（A）2. 7 验证实验按照 2. 6 项下优选出的酒炖女贞子炮制工艺条件制备 3 批样品,分别测定各指标成分的含量,并按 2. 6 项下的方法求出综合评价值 Yc,结果见表 4。验证实验

14、结果表明,优选出的酒制工艺稳定可控。表 4 验证实验样品各指标成分含量测定结果(n=3)样品 红景天苷 % 特女贞苷 % 综合评分 15233 小结与讨论3. 1 正交试验结果表明,酒炖女贞子的最佳炮制工艺为 :取净女贞子,加其重量 0.6%的食盐,加其重量 10%的水,闷润 0.5 h,蒸汽加热蒸制 1.5 h,蒸制时间是影响酒女贞子质量的主要因素,而食盐用量、水用量和闷润时间对盐蒸女贞子的质量无显著影响。3. 2 药理研究表明,红景天苷具有抗衰老、抗疲劳、抗寒冷、抗肝纤维化、抗肾间质纤维化、保肝、抗微波辐射等作用 7,特女贞苷具有免疫调节作用8。实验中亦对炖制时间的单因素进行过考察,结果随

15、着炖制时间的延长,红景天苷含量逐渐增加,而特女贞苷含量呈逐渐降低的趋势,分析是由于女贞子中的环烯醚萜苷类女贞苷、特女贞苷、女贞苷 G13、异女贞苷、新女贞苷、 10-羟基女贞苷都含有红景天苷的结构母核。长时间炖制后水解生成次级苷红景天苷所致。考虑到红景天苷为女贞子炮制后的增量成分而特女贞苷为其减量成分,且特女贞苷即使在酒炖时不被水解,进入体内后在胃酸的作用下也要部分水解,结合红景天苷和特女贞苷的药理作用及饮片的色泽,故在工艺评价时,给予红景天苷的加权系数大于特女贞苷。3.3 中国药典2005 年版一部女贞子药材项下只规定了齐墩果酸的限量 9,笔者曾对女贞子生品及不同蒸制时间盐制品中的齐墩果酸含量进行测定,结果表明,女贞子炮制前后齐墩果酸含量无明显变化,另外,齐墩果酸是脂溶性成分,这与