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1、SOOCHOW UNIVERSITY硕 士 学 位 论 文论 文 题 目 TLR2 激 动 剂 肽 聚 糖 在 结 直 肠 癌 放 疗 中 的 免疫 调 节 和 损 伤 修 复 作 用 及 机 制 研 究研究生姓名 吴 安 庆导 师 姓 名 张 学 光专 业 名 称 免 疫 学研 究 方 向 辐 射 免 疫论文提交日期 2013 年 4 月TLR2 激动剂肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用及机制研究 中 文 摘 要中 文 摘 要结 直 肠 癌 （ colorectal cancer， CRC） 是 人 类 最 常 见 的 癌 症 之 一 ， 随 着 我 国 生 活水 平 的 提 高
2、 ， 饮 食 结 构 的 改 变 ， 结 直 肠 癌 的 发 病 率 迅 速 增 长 ， 经 济 发 达 地 区 发 病率 已 接 近 西 方 发 达 国 家 （ 居 恶 性 肿 瘤 第 二 位 ）。 目 前 结 直 肠 癌 死 亡 率 列 我 国 恶 性 肿瘤 第 5 位 ， 且 逐 年 递 增 。结直肠癌的发生呈现出从正常组织，经过息肉、腺瘤、高 级 别 瘤 变 等 病 变 缓 慢 发 展 至 癌 的 漫 长 过 程 。 在 结 直 肠 癌 治 疗 过 程 中 ， 如 何 降 低肿 瘤 的 免 疫 逃 逸 能 力 ， 一 直 是 人 们 关 注 的 热 点 。放 疗 是 肿 瘤 治 疗 的
3、 主 要 手 段 之 一 ， 但 临 床 上 结 直 肠 癌 的 治 疗 手 段 以 手 术 和 化疗 为 主 ， 只 是 在 术 前 、 术 后 通 常 给 予 患 者 辅 助 性 放 疗 以 及 局 部 晚 期 与 肿 瘤 复 发 的姑 息 性 放 疗 。 这 是 因 为 在 目 前 的 放 疗 条 件 下 ， 腹 、 盆 部 受 到 中 等 剂 量 照 射 后 ， 小肠 即 可 出 现 黏 膜 上 皮 广 泛 性 变 性 、 坏 死 和 脱 落 ， 引 发 对 已 消 化 的 营 养 物 质 和 水 的吸 收 障 碍 ， 导 致 腹 泻 以 及 出 现 频 繁 呕 吐 、 水 电 解 质
4、 代 谢 紊 乱 等 急 性 放 射 病 症 状 ，限 制 了 放 疗 对 结 直 肠 癌 临 床 治 疗 的 效 果 和 应 用 。 因 此 ， 利 用 放 疗 有 效 地 治 疗 结 直肠 癌 和 肠 道 对 辐 射 的 敏 感 是 一 对 矛 盾 。 那 么 寻 找 一 种 既 能 协 同 和 增 加 放 射 治 疗 的效 果 ， 又 能 减 轻 辐 射 损 伤 促 进 其 修 复 的 药 物 和 制 剂 是 亟 待 解 决 的 科 学 问 题 。 本 论文 利 用 小 鼠 结 直 肠 癌 细 胞 株 在 BABL/c 小鼠皮下建立肿瘤模型，研究 Toll 样 受 体2(TLR2)激 动
5、 剂 肽 聚 糖 （ Peptidoglycan， PGN） 在 肿 瘤 放 疗 过 程 中 的 免 疫 调 节 作用 和 对 肠 道 辐 射 损 伤 的 修 复 作 用 及 其 机 制 。一、肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用【 目 的 】 建 立 肿 瘤 放 疗 模 型 ， 研 究 PGN 在肿瘤放疗过程中的免疫调节作用和 对 肠 道 的 损 伤 修 复 作 用 。【 方 法 】 首 先 建 立 正 常 BABL/c 小 鼠 腹 部 皮 下 荷 瘤 模 型 ， 将 模 型 鼠 分 为 4 组 ，分 别 是 不 处 理 组 （ untreated） 、 单 给 药 组 （ PGN
6、） 、 单 照 射 组 （ 15Gy） 、 照 射 加 给 药组 （ 15Gy+PGN） ，每组 30 只 。 接 种 肿 瘤 细 胞 7d 后 利 用 医 用 直 线 加 速 器 ， 对 荷 瘤小 鼠 进 行 腹 部 照 射 15Gy 电 子 束 （ 9MeV， 剂 量 率 为 2Gy/min） 。 照 后 1d 给 予I中 文 摘 要 TLR2 激动剂肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用及机制研究15Gy+PGN 组 和 PGN 组小鼠腹腔注射 PGN，给药量为 1.5mg/kg。 观 察 每 组 中 10只 小 鼠 的 生 存 率 以 及 肿 瘤 体 积 大 小 。 每 组 另
7、 有 20 只 小 鼠 分 别 在 照 后 1.25d、 3.5d、9d 取 肠 道 和 肿 瘤 ， 检 测 各 组 所 取 组 织 的 病 理 学 改 变 ， 小 肠 绒 毛 长 度 和 隐 窝 个 数 ，以 及 Ki67+细 胞 个 数 。【 结 果 】 (1)15Gy+PGN 组 的 体 重 减 轻 率 、 小 肠 病 理 形 态 、 绒 毛 长 度 、 隐 窝 个数和小肠隐窝增殖能力等指标和 15Gy 组相比具有统计学差异，小肠损伤程度较轻 。 (2)15Gy+PGN 的肿瘤体积增大受到抑制且照后未复发，15Gy 组 小 鼠 肿 瘤 在 照后 12d 复发，两组相比前者肿瘤的增殖能力受
8、到抑制。【 结 论 】 (1)本 论 文 首 次 发 现 PGN 在放疗后给药能够促进小肠辐射损伤的修复 ， 促 进 肠 道 功 能 的 恢 复 ， 提 高 放 疗 小 鼠 的 生 存 质 量 。（ 2） PGN 能 够 协 同 放 射 治疗 肿 瘤 ， 抑 制 肿 瘤 的 生 长 和 治 疗 后 的 复 发 。二、肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用机制【 目 的 】 从 肿 瘤 免 疫 应 答 和 细 胞 凋 亡 和 增 殖 信 号 通 路 两 方 面 ， 探 索 肽 聚 糖 在结 直 肠 癌 放 疗 中 的 免 疫 调 节 和 损 伤 修 复 作 用 机 制 。【 方 法 】
9、在 照 后 3.5d 取 各 组 肿 瘤 模 型 小 鼠 的 肿 瘤 和 小 肠 ， 利 用 液 氮 研 磨 法 ，抽 提 RNA 和 提 取 蛋 白 质 ， 先 从 mRNA 水平利用实时荧光定量 PCR 技 术 检 测 细 胞存 活 相 关 PI3K/Akt 通路中的各种基因相对表达量，利用免疫印迹技术检测相关蛋白 的 表 达 情 况 ， 得 出 受 PGN 调 节 的 基 因 。 利 用 免 疫 荧 光 技 术 检 测 各 组 肿 瘤 基 质 中CD8+T 细 胞 、 巨 噬 细 胞 、 B 细 胞 、 NK 细 胞 、 肥 大 细 胞 的 浸 润 情 况 。 研 磨 肿 瘤 组 织提
10、取 蛋 白 ， 利 用 酶 联 免 疫 吸 附 技 术 （ ELISA） 检 测 IL-21、 IL-1、 TNF- 三 种 细 胞因 子 的 表 达 量 。【 结 果 】 (1)15Gy+PGN 组小肠绒毛上皮和内皮细胞中 Akt3 表 达 水 平 上 升 ， 比15Gy 组 多 ； 但 是 15Gy+PGN 组 肿 瘤 中 的 Akt3 表 达 并 未 增 多 ， 和 15Gy 组 没 有 差别 （ 2） 15Gy+PGN 组肿瘤组织中 CD8+T 细胞、N K 细 胞 、 B 细 胞 、 肥 大 细 胞 、 巨噬 细 胞 浸 润 增 多 ， 细 胞 因 子 TNF-、 IL-1、 IL-
11、21 表 达 增 加 ， 与 15Gy 组 相 比 有 明显 统 计 学 差 异 。【 结 论 】 (1)PGN 能够上调 Akt3 的 表 达 ， 调 节 照 后 小 肠 绒 毛 上 皮 和 内 皮 细 胞 的IITLR2 激动剂肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用及机制研究 中 文 摘 要凋 亡 和 存 活 ， 促 进 小 肠 的 辐 射 损 伤 修 复 ， 改 善 肠 道 功 能 ， 提 高 放 疗 小 鼠 的 生 存 质量 。 (2)PGN 能够上调受照肿瘤组织中免疫细胞浸润和细胞因子表达的增加，从而抑 制 肿 瘤 生 长 和 其 治 疗 后 的 复 发 。综 上 所 述 ，
12、 本 论 文 研 究 发 现 了 TLR2 激动剂肽聚糖具有放射治疗肿瘤的协同作用 ， 同 时 能 够 促 进 正 常 肠 道 的 损 伤 修 复 ， 提 高 放 疗 的 疗 效 ， 降 低 副 作 用 。 并 初 步研究证实 PGN 在此过程中的作用机制是通过上调 Akt3 的 表 达 ， 调 节 辐 照 后 小 肠绒 毛 细 胞 的 存 活 ； 同 时 通 过 上 调 免 疫 细 胞 在 肿 瘤 基 质 中 的 浸 润 和 相 关 细 胞 因 子 的表 达 来 杀 伤 肿 瘤 ， 抑 制 肿 瘤 的 生 长 和 放 疗 后 复 发 。关 键 词 ： 肽 聚 糖 ； TLR2； 辐 射 损
13、伤 ； 肿 瘤 ； 小 肠作 者 ： 吴 安 庆指 导 老 师 ： 张 学 光陈 秋III英 文 摘 要 TLR2 激动剂肽聚糖在结直肠癌放疗中的免疫调节和损伤修复作用及机制研究Effects of TLR2 agonist peptidoglycan on immuneregulation and damage repair of colorectal cancerbearing mice after radiotherapyAbstractColorectal cancer is one of the most common human cancer. With the improveme
14、ntof living standards and diet changes, the incidence of colorectal cancer in China isincreasing rapidly. The incidence of the disease in economically developed areas isclose to that of the Western developed countries (ranking the second of all themalignancies). The mortality of colorectal cancer ra
15、nks the fifth among all themalignancies in China and has been increasing year after year. The pathogenesis ofcolorectal cancer is a long and progressing period from normal tissue, polyps, adenomas,high-level neoplasia (CIN) lesions, and eventually the malignant tumor.Although radiotherapy is among t
16、he most effective treatment of malignant, surgeryand chemotherapy are two major therapeutics on colorectal cancer patients.Radiotherapy could only be applied before and after operation as adjuvant therapy inpatients with locally advanced tumor or recurrent tumor. Because at present, even bymedium-dose irradiation on abdomen and pelvic, extensive degeneration, necrosis andshedding of the small intestine mucosa usually
