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1、高效液相色谱的基础知识,1,高效液相色谱法的特点,2,高效液相色谱法仪器工作原理,3,高效液相色谱仪的维护,4,高效液相色谱法仪的注意事项,5,高效液相色谱的分析应用,高效液相色谱法的特点,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,高效液相色谱法的特点,1高效液相色谱法与经典液
2、相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1.例如对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。,高效液相色谱法的特点,2高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
3、 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。,高效液相色谱法的特点,分析速度快通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。选择性高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，可分析同类型的有机化合物及其同分异构体，还可
4、以分析在性质上极为相似的旋光异构体。灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,高效液相色谱法的特点,超高效液相色谱(UPLC)是区别于HPLC的液相色谱新领域基于小颗粒填料和LC原理的一种创新技术实现超高分离度、灵敏度、分析速度,1,高效液相色谱法的特点,2,高效液相色谱法仪器工作原理,3,高效液相色谱仪的维护,4,高效液相色谱法仪的注意事项,5,高效液相色谱的分析应用,高效液相色谱仪工作原理, 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统,高效液相色
5、谱仪工作原理,其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,高效液相色谱仪工作原理,1高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅
6、速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,高效液相色谱仪工作原理,2进样装置,高效液相色谱仪工作原理,3 分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径
7、为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,高效液相色谱仪工作原理,4检测系统 目前有两种基本类型的检测器: 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另
8、一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，蒸发光散射，电导检测器等。,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 工作原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。 通用型检测器约有80的分析样品具有紫外吸收,可以使用这种检测器检 测。,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 优点:a: 灵敏度高b: 线性范围广 C: 对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱限制:a: 没有紫外吸收的物质不能检测b: 应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相 (限制了一些截止波长在200300nm之间的良
9、好溶剂的使用 ),高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 原理: 物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能 级，这些电子从高能级 跃至低能级时，物质会发出比入射光 波长较 长的光，这种光称为荧光。荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱.荧光检测器是一种选择性检测器 不到20%的物质使用这种检测手段,许多药物采用这种检测方法.,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 优点: a: 灵敏度非常高(灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高 )，比紫外检测器高23个数量级，适合于痕量分析 b: 可以用于梯度洗脱 c: 对仪器的稳定性（如温度和
10、压力的稳定性）依赖较小 d: 选择性好，优于紫外缺点: a:适用范围有一定的局限性 只适用于有荧光基团衍生化之后有荧光基团的化合物 b: 定量分析时线性范围较窄 它适合于 稠环芳烃、氨基酸、胺类、维生素、蛋 白质等荧光物质的测定,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器原理: 光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器
11、（2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器与普通UV-VIS检测器不同之处: a: 普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。 而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测. b:普通UV-VIS检测器只能得到二维的谱图,而DAD可以得到三维图谱.,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器应用a: 色谱峰纯度检查b: 色谱峰鉴定三维色谱能提供更多全面的信息。,高效液相色谱仪工
12、作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器（4）示差折光率检测器 是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。生命科学中常遇到各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般常用示差折光检测器。它的通用性比UVD广，但灵敏度要低，对温度变化敏感，并与梯度洗脱不相容，因而限制了它的使用。,高效液相色谱仪工作原理,（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器（4）示差折光率检测器（5）电导检测器 电化学检测器（ECD） ECD是根据物质的电还原性和电氧化性来进行检测的，应用于对紫外光没有吸收或不能发出荧光，但具有电活性的物质测定。若结合衍生技术，也可应
13、用于非电活性物质的检测。安培检测器和电导检测器在生化、医学、食品和环境分析中获得广泛的应用。,1,高效液相色谱法的特点,2,高效液相色谱法仪器工作原理,3,高效液相色谱仪的维护,4,高效液相色谱法仪的注意事项,5,高效液相色谱的分析应用,高效液相色谱仪的维护,泵的使用和维护防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2m或0.45m）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质，
14、含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作
15、,高效液相色谱仪的注意事项,柱的使用和维护1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。2、使用符合要求的流动相； 3、使用保护柱； 4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； 使用过程中注意轻拿轻放。,高效液相色谱仪的维护,流动相的脱气 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。,高效液相色谱仪的维护,紫外灯的保养： 在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。,1,高效液相色谱法的特点,2,高效液相色谱法仪器工作原理,3,高效液相色谱仪的维护,4,高效液相色谱法仪的注意事项,5,高效液相色谱的分析应用,高效液相色谱仪的注意事项,
