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1、微生物论文微生物及其代谢物快速检测技术的研究摘 要我们的日常生活与食品微生物密切相关，例如食品发酵、食品腐败、食品中毒属三个类群的微生物。食品微生物在许多食品的上产中起着至关重要的作用，其中细菌和真菌是导致食品腐败变质的主要元凶，食品中微生物的检测技术和自动化的发展，时刻影响着我们的生活。食品微生物检测技术很多，比较传统的方法是依靠培养基进行培养、分离及生化鉴定。随着科学技术的发展和科研水平的不断日高，微生物的快速检测技术越来越受到众多科研人员的青睐，微生物论文2成为科研的热点。关键词：食品安全;微生物;快速检测技术微生物快速检测法的国内外研究现状微生物快速检测技术在在国内外成为愈来愈热的话题
2、好人研究课题，目前国内外的快速检测方法主要有以下几种。1.多聚酶链式反应 PCRPCR 技术是由 Kleppe3等人在 1971 年首先提出的。该方法通过对人工难以培养的微生物相应 DNA 片段的扩增，检测扩增产物含量，从而快速地对食品中致病菌含量进行检测。检测时，首先在高温下(95)使得蛋白质变性，DNA 双链变成单链；再迅速降温(55)，每条 DNA 单链退火，这就是所谓的热循环。之后温度重新上升到 95，开始新的循环。经一套扩增循环(21 到 731 次)将一个单分子 DNA 扩增到 10 分子。整个过程可以在 1h 内通过自动热量循环器完成。理论上，只要样品中含有一分子沙门氏菌的 DN
3、A，通过 PCR 技术完全可以在短时间内检测到。这种测定方法的优点是测定结果迅速，灵敏度和特异性高，检测成本低。2.酶联免疫法 ELISA抗原抗体反应法是测定特异性致病菌及其产生毒素最常用的方法。ELISA是利用抗原和抗体之间的反应，在临床医学领域的许多方面都有应用。抗体在抗血清中可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。这两种抗体在 ELISA 技术中对于沙门氏菌、大肠杆菌 O157:H7、李斯特菌等血清型细菌有很好的检测效果。检测时首先将抗体吸附到固体载体上，然后再加富集培养物，使抗体将样品中所有目的抗原结合到固体载体上。实际中常使用一种夹心模式，在该模式中，先将第二个酶标抗体加入样品中，然后
4、加入一种能与第二个酶标抗体发生阳性颜色反应的反应底物。如果样品中没有目的抗原，酶标抗体就无法结合，也就不会发生颜色反应，反之就可以认为该样品呈阳性。3. 直接表面荧光滤膜计数技术(DEFT)这是一种能迅速且直接测定样品中微生物负荷量的生物化学检测法。最初英国微生物论文3科学家是为了对牛奶样品进行检测而开发设计，目前该方法已经应用到乳制品、肉类制品、饮料、水和污水等物质的检测中。该项检测技术需要使用膜过滤技术和表面荧光显微镜，将样品进行预培养后，利用 DEFT 计数。该项技术能在24h 内预测 5和 11下保存的巴氏杀菌乳的质量是否一致。每个样品的检测时间约 25min，费用较低。4.生物感应器
5、 biosensor生物感应器，既可以辨认一个分子的信号，也可以辨认大量分子的信号。整个细胞都可以用作生物感应器。在应用微生物领域游乐广阔的发展前景，检测对象包括毒素(葡萄球菌肠毒素、海豚毒素、贝类毒素等)、特定的致病菌(例如沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌 157:H7 等)。其基本原理虽简单，但在实际应用中需要许多仪器共同完成。近几年来，人们普遍较为关注“生物芯片”和“微芯片”在食源性致病菌等微生物的检测。在设计生物芯片时，可以在芯片上加上不同种类的抗体或者 DNA 分子，以便在同一个芯片上同时完成对沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、葡萄球菌等的检测。据 Heron 报道(2000 年)，生物芯片
6、在本世纪中叶会有举足轻重的作用，其市场价值可达 50 亿美元之高 3 。新型快速检测技术的发展与研究1.金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌生物学特征 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一种，属于革兰氏阳性菌。直径为 0.81.5m，金黄色葡萄球菌无鞭毛、芽胞，少部分有荚膜，不能运动。为需氧或兼性厌氧菌。最适宜的生长温度为 37，PH 值为 7.4。金黄色葡萄球菌具有高度的耐盐性，在高盐培养基中可以良好的生长。金黄色葡萄球菌还可以分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖产酸不产气。其可以分解甘露醇，还可以产生溶血物质，因此在血平板上培养会产生溶血环。其产生的血浆凝固酶可以使血浆产生凝固，这也是金黄色葡萄
7、球菌区别于其他葡萄球菌的的主要性质。还可以还原硝酸盐，产生脂酶和卵磷脂酶，因此在 Baird-Parker 培养基上培养的金黄色葡萄球菌可以在菌落周围产生沉淀环和透明圈。金黄色葡萄球菌在一般的营养物质中就可以良好的生长，但是只有当生长条件如营养成分、温度、水分活度、pH 等条件适宜的情况下才会产生肠毒素，而肠毒素的微生物论文4产生是导致食物中毒的原因。金黄色葡萄球菌抵抗外届不良环境的能力很强，在 80条件下加热达到 30min 才能使其死亡。 金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌可以产生多种毒素，这也是金黄色葡萄球菌导致食物中毒的原因，其分泌的毒素经过血清学鉴定包括 14 种，其中 SEA
8、和 SED 是细菌性食物中毒中最常见的肠毒素，其次是 SEB、SEC 。当人体摄入几微克的肠毒素就可以导致食物中毒。同时金黄色葡萄球菌还能产生 、 四种溶血毒素、这些溶血毒素可以导致血小板和溶酶体损伤，杀白细胞素、血浆凝固酶、表皮剥落毒素、毒性休克综合征毒素-1 等多种致病性毒素。有的毒素可以导致人的白细胞和巨噬细胞的损坏，有的可以导致血液中的纤维蛋白沉积，这些均可以导致人体治病。此外，在人类的化脓感染致病菌中，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌。金黄色葡萄球菌甚至还可以引起人类的化脓感染，肺炎、心包炎等多种疾病。 金黄色葡萄球菌的快速检测 4微生物快速检测系统是以计算机视觉技术为基础，将原有的呈
9、像设备如显微镜、摄像头等通过单片机控制系统与以 VC+、 C 语言、MATLAB 等编程语言编制的分析软件相结合。通过对细菌涂片进行显微镜识别、图像采集、图像分析处理，完成对目标细菌的识别和计数。该系统可实现显微镜手动或自动对焦，利用摄像机手动或自动采集视野中的细菌图片，应用计算机对采集到的细菌图片进行分析处理、提取特征参数如平面参数、光度参数等，最后对量化的特征参数指标进行模式识别，对检测结果的输出。 与传统的微生物检测方法相比，WKJ-II 型微生物快速检测仪具有以下特点： (1)能够对细菌图片进行自动对焦采集，实现了图像采集条件的统一，不仅消除了外界光源对采集样品的影响，自动对焦的程序设
10、计也减少了人为的主观判断的误差。 (2)该检测系统利用计算机对采集到的图像进行分析处理，通过对采集到的图像参数量化后进行统计分析，真正实现了快速、准确的检测目标微生物，同时对采集到的图像可以存储，弥补了传统检测法无法传输和分享的不足。 (3)该系统采集到的是分辨率较高的数字化彩色图像，存储介质多、同时可以实现多次拷贝以及对图像进行颜色、亮度、锐度等编辑操作。 (4)设备成本低廉，易于操作、设备轻巧，携带方便。 微生物论文5该系统通过单片机及相应的开发程序把图像采集设备和图像处理、识别程序相链接，以计算机视觉技术为基础研发设计出的微生物快速检测设备。该系统可以实现图像的自动对焦、图像采集、图像分
11、析，输出检测结果等操作，同时结合快速检测的样品前处理操作方法，不仅实现了该系统的高效性，同时也使检测结果的准确性得到了提高 4。2.链霉素链霉素（Streptomycin，SM）具有性质稳定、抗菌谱广、生产工艺简单、疗效好等特点，尤其对结核分枝杆菌有强大抗菌作用，是一种广泛应用于动物疾病治疗、预防的氨基糖苷类抗生素。但链霉素具有严重的耳毒性和肾毒性，它在动物源性食品中的残留已引起国内外的普遍关注。开发快速、准确、经济的检测链霉素类抗生素残留的方法在生产和生活中具有重要意义。 奚茜 6对检测链霉素的技术进行研究，获得以下结果： 1. SM 人工抗原的制备与鉴定：采用碳二亚胺法（EDC）和戊二醛法
12、（GA）将分别与牛血清白蛋白（BSA） 、卵清白蛋白（OVA）偶联，制得免疫抗原（SM-cBSA）和包被抗原（SM-OVA） 。经紫外扫描和 SDS-PAGE 电泳鉴定， SM 成功偶联到蛋白质载体上，偶联比分别为 7.6:1 和 17.7:1。 2. SM 多克隆抗体和单克隆抗体的制备与鉴定：将 SM-cBSA 分别免疫新西兰大白兔 6 只和 Balb/C 小鼠 3 只，用间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 测定抗血清效价和半数抑制浓度，并在小鼠多抗的基础上筛选最佳融合小鼠，制备单克隆抗体。 经 8 次免疫新西兰大白兔，获得了兔多抗（rSM pAb） ，经鉴定，其效价可达为 1: 8
13、000，阻断 ELISA 测定半数抑制浓度（IC50）为 3.32 ng/mL，与链霉素和双氢链霉素的交叉反应率分别为 100%与 120.78%，与其它化合物的交叉反应率（CR%）0.1%。经 5 次免疫 Balb/C 小鼠，获得效价可达 1: 80 000，IC50 为 3.44 ng/mL 的鼠多抗（mSM pAb） ；根据间接 ELISA 结果，选择 2 号小鼠细胞做细胞融合，筛得一株敏感特异的杂交瘤细胞 1G1-E3，用体内诱生腹水法制备鼠单抗（mSM mAb） ；经间接 ELISA 鉴定，细胞培养上清和腹水的效价分别为 1: 1 280 和 1: 1106，阻断 ELISA 测定其
14、 IC50 为 2.91 ng/mL，与其他化合物的 CR% 均0.01%。本实验制备多抗和单抗均可用于 SM 残留检测的免疫学试验，但 mSM mAb 的性能更好。 3.应用 mSM mAb 研制 SM 残留快速检测阻断 ELISA 试剂盒（SM-Kit） 。SM-Kit 的标准曲线呈 S 型，线性检测范围为 0.540.5 ng/mL，IC50 为 3.60 ng/mL；牛奶、蜂蜜样品的平均添加回收率均在 80%120%之间；批内和批间变微生物论文6异系数均小于 15%；除与双氢链霉素有交叉反应，与其他化合物的交叉反应率均小于 0.01%，不同生物基质对 SM-Kit 的检测结果影响小；稳
15、定性试验表SM-Kit 在 4可保存 6 个月以上。 4.建立了基于两种基于适配子的 SM 残留快速检测方案，两种方案的检 IC50 分别为 160.83 ng/mL 和 168.16 ng/mL，初步证明方案的可行性，并为进一步研究奠定良好基础。 研究初步地建立了基于适配子的链霉素残留检测方法，有望进一步建立直接竞争 ELISA 法从而提高检测灵敏度和缩短检测时间 6。3.黄曲霉素 11黄曲霉毒素(Aflatoxin;简写 AFT)可由黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和伪溜曲霉等曲霉菌产生,是一组化学结构类似的双呋喃香豆素衍生化合物,口前已分离鉴定 12 种,包括:AFTBi、B2、Gi、G2、M
16、l、M2、P、Q、H、GM、B2a 和毒醇。4 种主要的黄曲霉毒素包括 AFT Bi、AFTB2、AFTGi 和 AFTG2,加上 AFT B,和 AFT B2 的代谢产物 AFT M,和 AFT M2,可以直接污染食品和词料。AFT 的基本结构是双呋喃环和香豆素,在紫外光下,AFT Bi 和 AFT B2 发蓝色焚光,AFT Gi 和 AFT G2 发绿色焚光,AFT Mi 和 AFT M2 发蓝紫色焚光。AFT Ml 和 AFT M2 是 AFT B,和 AFT B2 在动物或微生物体内经过轻化而产生的代谢产物。黄曲霉毒素 M 毒素最先是从牛奶中分离出来的,奶牛在食用被黄曲霉毒素 B 污染的草料或饲料后,通过体内代谢产生了黄曲霉毒素 M 毒素,该类毒素包括黄曲霉毒素 Ml 和 M2。目前,AFT Ml 和 AFT M2 的研究主要是针对乳及乳制品、婴儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品、特殊医学用途婴儿配方食品这类产品。然而,已有文
