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1、1 实验一 植物组织游离氨基酸含量测定 茚三酮试剂显色法 P199 原理 ：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚 -二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称 Rubemans 紫。其吸收峰在 570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。微酸、 90：氨基酸被氧化形成 CO2、 NH 3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚 -二酮茚胺。材料 ：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。实验步骤 ：分别取 1g 萌发、未萌发水稻于研钵中，加入 5ml 醋酸（使蛋白质变性，沉淀） ，研磨成匀浆后，用无
2、氨蒸馏水稀释至 100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作试管编号试剂空白 1 样品 1（未萌发） 样品 2（萌发）2 3 4 5 样品提取液 ml 0 2 2 2 2 无氨蒸馏水 ml 2.0 0 0 0 0 0.1 抗坏血酸 ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 水合茚三酮 ml 3 3 3 3 3 570nmOD 值 0 0.130 0.123 0.188 0.168 每管含氮量 0 1.26 1.19 1 83 1.83 置于沸水中加热 15min， 取出用冷水迅速冷却并不时摇动， 使之呈蓝紫色， 用 60%乙醇定容 20ml ， 在 570nm波长下测定吸光度。样品氨基态
3、含氮量 （ ug/100g 鲜重） =CV T/V SW *100 ； C=A/k (k=0.103) ； V T=100/2 ； V S=1 ； W=1 注意事项：1. 测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2. 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3. 抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4. 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90， 15min 后取出迅速冷却，再加入 60%乙醇；5. 稀释后要迅速比色；6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含
4、量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适 PH 为 4.5，是乙醇 -乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的 PH。思考题：1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。2. 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。3. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用 10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。4. 抗坏血酸在测定中的作
5、用是什么？作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。722S型分光光度计使用： 空白，开启，透射比 0%，关上， 100%。吸光度模式2 实验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定 Folin 酚试剂法 P188 原理 ： Folin 酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质 -铜络合物。络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使 Folin 试剂（磷钼酸 -磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质。在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在 650nm，因此可用分光光度法测定其含量。材料 ：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌
6、发两天的水稻。实验步骤：分别取 0.5g 萌发、未萌发水稻于研钵中 +2ml 蒸馏水 +石英砂，充分研磨， +3ml 蒸馏水，定容 25ml，放置 15min，过滤取上清液备用。如下操作编号 1 2 3 4 5 6 未萌发 萌发牛血清蛋白250ug/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 酶 0.5 酶 0.5 蒸馏水 ml 1 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 试剂甲 ml 5 摇匀室温下放置 10min 试剂乙 ml 0.5 迅速摇匀室温放置 30min 650nmOD 值 0.000 0.112 0.154 0.255 0.474 0.551 0.167
7、0.237 蛋白质含量 0 50 100 150 200 250 71.8 104.8 样品蛋白质含量（ mg/g 鲜重） =XV TN/WV S *1000 ； V T=25； W=0.5； V S =0.5 注意事项 ：1. Folin 酚试剂只有在酸性条件下才稳定；2. 试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀；3. 反应最适温度在 25-30；4. 样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干扰。思考题 ：1. 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。 Folin- 酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰考马斯亮蓝 G-250 法 优点：
8、灵敏度大、操作简单 缺点：易造成二次污染紫外分光光度法 优点：节约样品、操作简单 缺点：准确度差2. 测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举例说明。可以测定植物的代谢水平、食品中的营养指标。3. Folin- 酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？测定中应注意什么问题？原理。 。 。测定时要注意最适温度为 25-30， Folin- 酚试剂只有在酸性条件下才稳定，并会受到柠檬酸等化合物的干扰。3 实验三 植物组织 Vc 含量测定 滴定法 P268 原理 ： Vc 具有很强的还原性，染料 2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当用蓝色碱性 2,
9、6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将 2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴加 2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色，借此可指示滴定终点。根据滴定消耗的 2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可计算出被测样品中抗坏血酸的含量。材料 ：白萝卜操作步骤 ： 5g 白萝卜于研钵中，加入少量 2%草酸和石英砂，快速研磨成匀浆，用 2%草酸洗入 100ml 容量瓶中并定容，过滤，滤液备用。以 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉红色，并在 15s 内不褪色为终点。试剂 1 空白 2 染料标定 ml 3染料标定 ml 4 样品 ml 5 样品 ml
10、2%草酸 10 0 0 0 0 标准 VC(20ug/ml) 0 10 10 0 0 样品提取液 ml 0 0 0 10 10 2,6-二氯酚靛酚燃料滴定 ml 0.15 Y1 2.78V1 2.75V1 0.98Y0 1.02Y0样品 VC 含量（ mg/100g 鲜重） =（ YO-Y1 ） A/W *V T/V S *100 ； A=10ml*20/V1-Y1 *10 -3V T=100 ； V S=10 ； W=5 注意事项：1. VC 很容易被还原，研磨要快速，滴定也应控制在 2min 以内；2. 2,6-二氯酚靛酚很不稳定，每次实验时需重新测定浓度；3. 若样品溶液有较多泡沫，可适
11、当加丁醇思考题 ：1. 为什么在测定 VC 的同时要进行 2,6-二氯酚靛酚溶液的标定？2,6-二氯酚靛酚溶液很不稳定。2. 为了保证抗坏血酸含量准确测定，操作过程应注意些什么？VC 很容易被还原，需要快速研磨、快速匀浆、快速滴定，并要避免阳光直射，避免用铜、铁器具接触白萝卜。并用 2%草酸抑制酶活性，避免 VC 分解。4 实验四 植物硝酸还原酶活性的测定 活体法 P126 原理 ： NR 催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。 产生的亚硝酸盐与对 -氨基苯磺酸 （或对 -氨基苯磺酰胺）及 -萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生产红色偶氮化合物。在 540nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测
12、定。 NR 活性可由产生的亚硝态氮的量表示。材料 ：甘薯叶片操作步骤 ： 取 2 张不同的甘薯叶片， 洗净后吸干水分，打孔后混匀，迅速取 0.3-0.4g 样品 3 份于三角瓶中。1（对照） 2（样品 1） 3（样品 2）30%三氯乙酸 ml 1 0 0 KNO 3（磷酸缓冲液） ml 9 9 9 真空干燥箱抽气 10min叶片下沉恒温培养箱 30暗处 30min酶促反应30%三氯乙酸 ml 0 1 1 540nmOD 值 0 0.031 0.030 3 份各取 1ml 于试管 +2ml 1%磺胺 +2ml 0.02%萘基乙烯胺，摇匀，显色 15min，以 1 号管作参比，在540nm 下比色
13、。样品中硝酸还原酶活性 ug/(g.h) 鲜重 =（ X/V S） V T /WT X=OD 值 /k k=0.307； V S=1； V T=10ml ； W=0.32 ； T=0.5h 注意事项：1. 硝酸还原酶易失活，操作应迅速；2. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨，并严格控制反应时间；3. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。4. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位要一致。思考题 ：1. 测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应在晴天进行？硝态氮肥即硝酸盐，硝酸还原酶是诱导酶，硝酸盐诱导硝
14、酸还原酶的合成，为实验提供足量的酶。晴天植物进行光合作用，积累足够的 NADH 和碳水化合物（能量）提供反应。2. 测定硝酸还原酶活性的离体法和活体法各有何特点？活体法：步骤简单，适合快速、多组测定。本实验不需外加 NADH 。但重复性不好，受生物本身性质影响。离体法：步骤复杂，但重复性较好，反应条件受人为控制。研磨易使酶失活， NADH 在空气中易被破坏，要外加 NADH 。3. 酶的诱导为什么要在暗处进行？亚硝酸盐在光照下易分解，叶绿素光合作用产生的一些辅酶会加快亚硝酸盐分解。5 实验五 淀粉酶活性的测定 P174 原理 ：淀粉酶包括 -淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等。淀粉酶活力的大小
15、与产生的还原糖的量成正比。可用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是 -淀粉酶、 -淀粉酶。 -淀粉酶不耐酸，在 PH3.6 以下迅速钝化； -淀粉酶不耐热，在 70保温 15min 则被钝化。本实验采用加热钝化 -淀粉酶测出 -淀粉酶的活力， 再与非钝化条件下测定的总活力 （ + ） 比较，即可求出 -淀粉酶的活力。材料 ：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。操作步骤 ：各取 1g 种子，低温置于研钵中 +少量石英砂 +2ml 蒸馏水，研磨成匀浆，过滤后于 100ml 容量瓶
16、，用蒸馏水定容，即为淀粉酶原液（酶液 1） 。取原液 10ml 于 50ml 容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶稀释液（酶液 2） 。如下操作1-1 1-2 2-1 2-2 酶液 1 ml 1 1 0 0 钝化 -淀粉酶 置 70水浴中 15min，取出后在流水中冷却酶液 2 ml 0 0 1 1 3,5-二硝基水杨酸 ml 2 0 2 0 预保温 40恒温水浴中保温 10min 1%淀粉溶液 ml 40 1 1 1 1 保温 40恒温水浴中保温 5min （酶促反应）3,5-二硝基水杨酸 ml 0 2 0 2 摇匀，置沸水浴 10min，取出后冷却，加蒸馏水至 20ml 。在 540nm 波长下比色。试管编号项目测定 -淀粉酶 测定（ + ） -淀粉酶 参比管未萌发 萌发 未萌发 萌发A 对 A 测 B 对 B 测 C 对 C 测 D 对 D 测540nmOD 值 0.188 0.166 0.207 0.255 0.1
