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1、实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,张达威,主要内容,荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用,荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。,传统PCR定量与实时定量PCR,传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限 检测重现性极差 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测： 灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量,Gel-based quantification,11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference,Real-time q
2、uantification,Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold difference,重复性好精确度高误差小,传统PCR与实时定量PCR,阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。,阈值与CT值,C(t)值与阈值,荧光定量PCR原理,起始模板浓度的对数与C(t)值成反比,如何定量,绘制标准曲线所测样本C(t)值定量,标 准 曲 线
3、,通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量,荧光定量PCR方法,荧光染料法荧光探针法,SYBR Green ITaqManMolecular Beacons,DNA binding,Probe based detection,染料和探针,SYBR Green:最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物需要做熔解曲线分析产物的单一性,SYBR gre
4、en 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。,SYBR Green法作用机理,熔解曲线分析,单一峰，无非特异性产物，定量准确,有杂峰，有非特异性产物，定量不准确,特点： 特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列,Taqman探针法,Taqman探针：是与目的序列互补的寡聚核苷酸，5端标记荧光报告集团，3端标记荧光淬灭集团，探针完整时不发出荧光，水解后发出荧光。,Taqman 三通道实验,Daniel Candotti - Cambridge,
5、UK,绝对定量相对定量SNP分析,实时定量PCR应用,应用之一：病原体检测与定量,绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原体的多少）标准品（如质粒）：做系列梯度稀释待测样本阴性对照（NTC）,应用之一：病原体检测与定量,1,4,3,2,应用之一：病原体检测与定量,应用之二：基因表达差异分析,相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因,应用之二：基因表达差异分析,Calibrator,Gene of Interest目的基因, Ct1,应用之二：基因表达差异分析,基因表达差异2 /2, C
6、t1, Ct2,2, Ct1 - Ct2,应用之二：基因表达差异分析,RNA抽提,RT,定量PCR,cDNA产物,系列稀释,两个基因的扩增效率,应用之二：基因表达差异分析,1,2,3,4,应用之二：基因表达差异分析,两条探针分别针对不同等位基因,A,C,G,T,A,C,G,T,应用之三：SNP分析,应用之三：SNP分析,FAM,TET,FAM,TET,1,2,应用之三：SNP分析,2,1,Thank you！,选择吉泰，选择成功！,试验设计与优化,PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复性。影响扩增效率的因
7、素：扩增子长度；扩增子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。,引物设计原则,扩增片段100-200bp引物长度18-30bp，Tm在58-62之间，上下游引物Tm值不超过2GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基，3端不为G或C。避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增,探针设计原则,Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72之间，确保比引物的Tm值大5-10GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基5端不能为G，G能淬灭荧光信号Taqman探针要靠近上游引物，最好只有一个碱基距离。避免探针与引物间形成二级结构
8、SNP位点应设计在探针中间位置,实时PCR体系优化,基本参数的优化MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30之间。而CP值的确定经验上是SYBRGreen荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度是本底的0.3倍。,使用SYBRGreen测定DNA的优化MgCl2的浓度，2-4mM模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106拷贝引物浓度，0.3uM退火浓度，比计算出的Tm小5,使用SYBRGreen进行一步法RT-PCR的条件优化MgCl2的浓度，4-8mM模板浓度，总RNA或mRNA：1pg-1ug,杂交探针测定DNAMgCl2的
9、浓度，不要超过2mM探针浓度，0.2uM,杂交探针进行实施定量RT-PCRMgCl2的浓度，4-8mM之间探针浓度，0.2uM模板浓度设置， 1pg-1ug的总RNA或是mRNA,荧光定量PCR仪的硬件条件,激发光源,热循环加热、制冷,检测设备,荧光定量PCR仪应满足的要求,光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.,Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧洲与日本设有分公司. 2007年被Agilent公司收购，成为Agilent公司旗下品牌。,Stratagene 公司简介,Mx3000P 整体设计,仪器优势,石英卤钨灯的激发光源：超长的激发光范围350-750nm多通道设计，滤光片可灵活定制卓越的孔间均一性和温度控制，72时+0.25光学扫描设计: 避免边缘效应；光电倍增管增加检测的灵敏度内置芯片，具有断电保护功能人性化的软件，实时监测，直观易用，功能强大,开放的平台，选择你心仪的试剂与耗材完善的售后支持，您的满意是我们最大的目标,本文观看结束！,谢 谢欣 赏！,
