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1、1中华按蚊多态微卫星 DNA 位点的筛选和特征研究【摘要】 目的： 对中华按蚊多态的微卫星 DNA 位点进行分离和筛选，并阐明其特征. 方法： 应用中华按蚊基因组 DNA 的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交，亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段，扩增放大，克隆并测序，构建中华按蚊微卫星 DNA 库. 在其中挑选合适的微卫星位点，建立扩增体系. 应用中华按蚊现场样本扩增不同的微卫星位点，聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的微卫星位点. 结果： 构建的中华按蚊微卫星 DNA 库中包含 252条序列，GenBank 注册登记号为 EF620047EF620298. 其中，双核苷酸重复最为常见，三核苷
2、酸重复次之，多核苷酸重复少见；含（CA）和（GT）重复的序列最多，重复次数最多可达 56 次；完整序列占 35.3%，非完整序列占 20.2%，复合序列占 18.7%，其余为非典型序列. 设计了 22 对引物扩增不同的微卫星位点，其中 20个位点产生特异的 PCR 产物，PAGE 结果显示其中 15 个位点具有多态性. 结论： 获得了中华按蚊新的多态微卫星位点共 15 个，为中华按蚊群体遗传和其他相关研究提供了分子标志. 【关键词】 中华按蚊；微卫星 DNA 0 引言 微卫星 DNA 是一类简单的短核苷酸串联重复序列，又称简单重复序列，广泛分布于真核生物的基因组中，每间隔 1050 kb 即存
3、在一个微卫星 DNA. 微卫星 DNA 包括核心序列和两侧的侧翼序列，2通常核心序列重复单元长 16 bp，重复次数为 1060 次，其重复次数的差异导致微卫星 DNA 具丰富的长度多态性1-2. 微卫星 DNA 已经广泛应用于研究生物多样性、群体遗传结构、行为生态和亲缘关系等3 ，是一种理想的的分子标志. 中华按蚊（Anopheles sinensis Wiedemann, 1828）在我国分布广且种群数量大，是以往文献记载中疟疾和丝虫病的重要传播媒介4-5. 本研究拟构建中华按蚊的微卫星 DNA 库并筛选其中多态的微卫星位点，为中华按蚊基因组学研究积累基础资料，并为其相关研究提供新的分子标
4、志. 1 材料和方法 1.1 材料构建中华按蚊微卫星 DNA 库的样本为上海实验室品系，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供. 现场中华按蚊采自云南思茅（200508 ，n=10） 、云南盐津（200607 ，n=10）和湖北武汉（200607 ，n=10） ，选择雌性成虫为实验材料. 1.2 方法 1.2.1 微卫星 DNA 库构建基因组 DNA 的抽提参照 Hammond等的文献进行6 ，-20保存待用. 基因组 DNA 经 Sau3AI 酶切，回收 200 800 bp 的片段，加 SAUL 接头连接，接头序列如下：SAULA：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB
5、 ：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以 SAULA 为引物，连接产物作为模板PCR 扩增，反应液中含 PCR 缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2，0.2 3mmol/L dNTP，0.8 mol/L 引物，0.6 U Taq 酶（上海生工生物工程有限公司）和 2 L 模板，在热循环仪（PTC100 ，美国 ABI公司）上执行如下程序：72 5 min 后，94 1 min，67 1 min 和 72 2 min 共 32 个循环，72延伸 5 min. 将扩增产物变性后，与 Biotin16dd UTP（瑞士 Roche 公司）标记的寡核苷酸探针杂交，探针包括：(AAT
6、)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8 和(TG)18. 用亲和素Vectrex Avidin D（英国 Vector Labs 公司）捕获并超滤离心（美国 Millipore 公司）浓缩富集杂交的目的片段. 以富集的核酸作为模板，SAULA 为引物扩增，反应体系和程序同前. 随后，用 PCR 产物再次杂交、捕获、浓缩富集和扩增. 将上述扩增产物插入TOPOT 载体（美国 Invitrogene 公司） ，转化 E.coli JM109，挑选含微卫星 DNA 序列的阳性克隆，用四色荧光标记双脱氧链终止法测序（PEABI3770
7、 全自动测序仪，上海英骏生物技术有限公司） ，应用 BioEdit（Version 5.0.9）软件包分析所获序列 . 1.2.2 微卫星 DNA 多态位点筛选单蚊抽提现场中华按蚊基因组DNA，参照文献进行分子鉴别确认蚊种为中华按蚊7. 选择 22条重复次数较多，且典型的微卫星 DNA 序列，应用 Primer 3（Version 3.1）软件包设计引物 . 以单蚊基因组 DNA 为模板，PCR 扩增微卫星 DNA（反应体系和程序同前） ，退火温度范围在5560. 扩增产物经 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染、显色，依据凝胶上的条带判断其是否具有多态性. 42 结果 2.1 中华按蚊微卫星 DN
8、A 库构建的中华按蚊微卫星 DNA 库中包含 282 条序列，其中 18 条序列完全相同，21 条序列较短（小于100 bp） ，故有效的微卫星 DNA 序列共 252 条，GenBank 注册号为 EF620047EF620298. 分析所获的微卫星 DNA 序列，显示其长度范围为 50800 bp，大多数在 300 bp 左右. 就重复情形而言，双核苷酸重复最为常见，三核苷酸重复次之，多核苷酸重复少见；含（CA）和（GT）重复的序列最多，重复次数不等，最多可达 56次. 所获的微卫星 DNA 依据文献8标准划分，结果完整序列为89 条（35.3%） ，非完整序列 51 条（20.2%） ，
9、复合序列 47 条（18.7%） ，其余为非典型序列（25.8%）. 2.2 中华按蚊微卫星多态位点设计并合成了 22 对扩增微卫星DNA 的引物，对现场样本进行扩增的结果显示，20 个位点有特异的 PCR 产物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（一条带为纯合子，两条带以上为杂合子） ，共有 15 个微卫星 DNA 位点具有多态性（表1）. 本研究的多态微卫星位点在退火温度为 55 时，均存在特异产物. 表 1 中华按蚊多态的 15 个微卫星位点特征 3 讨论 通过比较分析本研究所获中华按蚊微卫星 DNA 序列的特点，发现与已报告的冈比亚按蚊（An. gambiae） 9-10 ，催命按蚊（An. f
10、unestus） 11-12和穆歇按蚊（An. moucheti） 13 等相似，均为双核苷酸重复最常见，三核苷酸重复次之，多核苷酸重复少见. 5韩国学者 Jung 等14应用(GA)22 和(CA)22 寡核苷酸探针分离和筛选了韩国的中华按蚊微卫星 DNA 阳性克隆 48 个，与之比较，本研究应用了更多的探针，特别是三碱基重复序列的探针，分离的我国中华按蚊微卫星 DNA 序列，不仅重复单元序列多样化，而且序列的数量也较多，更具广泛性，极大地丰富了中华按蚊的微卫星DNA 序列数据库 . 通常一个理想的微卫星 DNA 标志应具备完整的重复序列，有相当长度的侧翼区（至少 15 bp）以适合引物设计
11、的需要. 本研究分离的中华按蚊微卫星 DNA 序列中，绝大部分的侧翼区有足够的长度可供引物设计. 笔者在检测的 22 个微卫星位点中，获得了 15 个具有多态性，提示中华按蚊微卫星位点的多态性比例较高，为68.2%（15/20） ，结果与文献报告的相似，如：韩国的中华按蚊为64.7%(11/17)14 ，催命按蚊为 57.4%（27/47 ） 11 和环跗库蚊（Culex tarsalis）为 60.0%(12/20) 15. 本研究中华按蚊的多态微卫星位点中等位基因数从 2 到 12 不等（未发表资料）也与文献报告的相当11, 14-15 ，筛选得到的中华按蚊多态微卫星位点与韩国学者报告的多
12、态位点无重复性14 ，均为首次报道. 致谢承蒙湖北省疾病预防控制中心黄光全、云南省寄生虫病防治所顾云安和第二军医大学杨曼尼协助采集现场标本，在此一并表示感谢. 【参考文献】 6 1 Yu QY, Li B, Li GR, et al. Abundance and distribution of microsatellites in the entire mosquito genomeJ. 生物化学和生物物理进展，2005, 32：435-441. 2 Christian S, Amos B, Tauze D, et al. Conservation of polymorphilc simple
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