《实验26 色素原底物反应测定酶活性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验26 色素原底物反应测定酶活性（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,贵阳医学院医学检验系黄海,实验 26 色素原底物反应测定酶活性,2,实验目的,掌握：色素原底物反应测定酶活性的原理。熟悉：熟悉连续监测法测定实验的操作步骤。了解：测定GGT、ALP和AMS的临床意义。,3,一、血清-谷氨酰基转移酶（GGT）测定,二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定,三、血清淀粉酶（AMS）测定,4,实验原理,（黄色化合物，=405nm） 在405410nm处监测吸光度变化。吸光度增高速率（A/min）与GGT活性呈正比，利用连续监测法酶活性的计算公式，求出GGT活性。,一、血清-谷氨酰基转移酶（GGT）测定,5,试剂与器材,底物缓冲液 Tris-HCl缓冲液110mmol/L
2、；双甘肽110mmol/L；L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺6.0mmol/L；pH(37) 7.7。2. 待测标本 病人血清或质控血清。,6,操作步骤,1. 手工操作 （1）37预温的底物缓冲液。 （2）在光径为1.0cm石英比色皿中加入血清100l及预温的底物缓冲液1 000l；在37，波长405nm连续监测60s吸光度的变化，求出A/min。,7,操作步骤,2. 自动化生化分析仪操作程序的设置 按手工操作要求设置参数为：,F值: 1 159；延滞期时间: 30s；连续监测时间: 60s；比色皿光径: 1.0cm；波长: 405nm；吸样量: 100l；温度: 37,8,计算,式中9 4
3、90为2-硝基-5-氨基苯甲酸在405nm处的摩尔消光系数。,9,参考范围,男性血清GGT: 11 U/L 50U/L （37）女性血清GGT: 7 U/L 32U/L （37）,10,临床意义,1. GGT主要用于诊断肝胆疾病 原发性肝癌血清GGT活性显著升高，急性肝炎、慢性肝炎活动期、阻塞性黄疸、胆道感染、胆石症、急性胰腺炎时都可以升高。2. 人体器官中GGT的含量按下列顺序排列：肾、前列腺、胰、肝、盲肠和脑。肾脏中GGT含量最高，但肾脏疾病时，血液中该酶活性增高不明显，可能是肾脏病变时，GGT经尿排出。3. 嗜酒或长期接受某些药物如安替比林、苯巴比妥、苯妥英钠等，血清GGT活性常升高。,
4、11,注意事项,1. 测定波长为405nm，2-硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔消光系 数，因仪器性能和精度不同存在差别，建议各实验室自 行测定。2. 甘氨酸对GGT反应有抑制作用，所用的双甘肽制剂中甘 氨酸含量应0.1%。溶血标本对测定结果影响不大，黄 疸和脂血不干扰本法测定结果。3. 血清GGT的活力在室温或4可稳定7天，在冷冻状态下 可稳定2个月。,12,评价,准确性和精确性都好，操作简便； 实验条件要求严格。,返回本实验目录,13,实验原理,二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定,ALP速率法测定的反应式为： 黄色（405nm）,14,试剂与器材,1. 试剂组成 试剂（R1）： 1.00mmol/
5、L二乙基氨基乙醇（EAE）缓冲液 、0.5mmol/L MgCl2。 试剂（R2）： 100mmol/L 4-NPP 、0.5mmol/L MgCl2。 若作单试剂法，可将试剂4份与试剂1份临用前混合成工作液。,15,试剂与器材,2. 生化分析仪测定条件,温度：370.1；光径：1.00.01mm；波长：4051nm；带宽：2nm。,16,操作步骤,单试剂法 标本10l+工作液500l 延迟时间60s 读数时间120s,17,计算,4-硝基酚（PNP）：18 500（405nm）,参考范围,成人血清ALP： 40 U/L 150U/L,18,临床意义,1. ALP可作为肝胆和骨骼疾病的辅助诊断
6、指标。 肝胆疾病，如阻塞性黄疸、急或慢性黄疸型肝 炎、肝癌等血清酶活力可增高。 发生骨骼疾病时，由于骨的损伤或疾病使成骨细 胞所含高浓度的ALP释放入血，引起血中ALP活 力增高。 2. ALP减少比较少见，主要见于呆小病、成骨不全 症、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症等。,19,注意事项,1. 血清置室温（25），ALP活性显示轻度升高。 例如，室温6小时，酶活性约增高1%，置14天 酶活性增高3%6%。血清存放冰箱（4），酶 活性也出现缓慢升高。冰冻血清，ALP活性降 低，但当血清复温后，酶活性会慢慢恢复。2. 本法的线性范围：0500U/L（37）。,20,三、血清淀粉酶（AMS）测定,实验
7、原理,21,试剂及器材,1. 磷酸缓冲液（pH7.10）2. 34 KU/L - 葡萄糖苷酶溶液 。3. 57.5mmol/L底物溶液。,22,操作步骤,1. 吸取-葡萄糖苷酶溶液400l，样品20l，预温至37，再吸入底物溶液40l，启动半自动生化分析仪监测。 2. 主要参数 温度 37；延滞时间3min；波长 405nm间隔时间 30s；监测时间 3min 。,23,计算,Vt为反应总体积（ml）；Vs为样品用量（ml）；L为比色皿光径（cm）；3为由产生4NP的mol数换算成被水解底物4NP-G7的mol数；E405nm为4NP的摩尔消光系数（37、30和25时分别为 10 600、9
8、500和9 000）,24,参考范围,血清淀粉酶（37）：220U/L,25,临床意义,1. 急性胰腺炎发病后812小时血清AMS开始升高，1224小时达高峰。25天下降至正常，若超过500U即有诊断意义，达350U时应怀疑该病。2. 尿AMS约于发病后1224小时开始升高，下降也较血清AMS慢，所以在急性胰腺炎后期测定尿AMS更有价值。3. 流行性腮腺炎，特别是胰腺炎时，血和尿中的AMS显著升高。4. 正常血清中的AMS主要由肝脏产生，故肝病时血清及尿中AMS可同时减低。,26,注意事项,1.Tris缓冲液抑制-葡萄糖苷酶，EDTA严重干扰测定，其它抗凝剂无明显影响。2. 血清淀粉酶十分稳定，置室温1周或冰箱2个月，酶活性没有明显变化。3.尿液呈酸性时，淀粉酶稳定性较差，因此尿液标本保存前，须将pH调节至7.0左右。,27,评价,本法线性范围可达2 000U/L，方法简便快速，精密度好，既适合自动化分析，也可手工测定，结果能以国际单位表示，是目前测定淀粉酶较为理想的方法 。,28,思考题,1. 简述测定GGT的基本原理？ 2. 简述测定血清GGT的临床意义。 3. ALP测定采用色素原底物法应注意哪些事 项？ 4. ALP测定还有哪些方法？ 5. 测定血清淀粉酶有哪些方法？ 6. 血清淀粉酶测定的临床意义？,29,谢谢！,返回总目录,
