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1、高效液相色谱法同时测定饮料中的 9 种食品添加剂作者：廊坊师范学院化学系 2005 届毕业生 祁楠指导教师：孙欣摘要:研究了等梯度高效液相色谱法直接测定饮料中的防腐剂、甜味剂、色素的方法。采用 C18柱以甲醇乙酸氨（0.02mol/L)溴化四丁铵(0.007mol/L),pH 6.0 为流动相,紫外检测波长为 230nm,可在 15 分钟内将山梨酸、苯甲酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红完全分离。关键词：高效液相色谱、山梨酸、苯甲酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红前言：高效液相色谱(HPLC)是上世纪 60 年代末 70 年代初,发展起来的一种新型分析分
2、离技术,它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压输送流动相和高灵敏度检测器,发展而成的现代化液相色谱分析方法, 具有分离效率高、 选择性好、 分析速度快、 检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广等特点。近年来，由于消费者对于食品的安全性日益的关注，食品中的各种添加剂越来越受到人们 的 重视。 食品添加剂指为改善食品品质和 色、香、味，而加入食品中的化学合成或天然物质，但在目前所使用的添加剂中，绝大多数为化学合成添加剂，它们是通过氧化、还原、缩合等一系列化学合成反应所得，有的具有一定毒性，有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物质。通过动物实验证明有些物质有致癌、致畸形等作用，
3、如果不加以限制使用，将对人体健康产生危害。高效液相色谱具备分离效果好、灵敏度高和重现性好等优点,因此是目前食品添加剂定性、定量分析的首选方法,本实验采用甲醇乙酸氨 (0.02mol/L)溴化四丁铵(0.007mol/L)（ 35：65：4，pH6.0）为流动相,能将食品中的食用色素、防腐剂、甜味剂、抗氧化剂、兴奋剂完全分离。1. 实验部分1.1 仪器与试剂ACS2000 高效毛细管电泳仪液相色谱一体机(北京彩陆科学仪器公司)、紫外可见光检测器(UV DETECTOR VK-2051)、PHS-2F 数字 pH 计（上海精密科学仪器有限公司） 、双频超声清洗机型号 SK8200LH(上海科导超声
4、仪器有限公司)、氨水溶液(分析纯氨水：原子水=1：9)、醋酸溶液(分析纯醋酸：原子水=1：9)标准储备液： VC、胭脂红、柠檬黄、日落黄、苋菜红 均为 1.0000g/L、苯甲酸、山梨酸 均为 5mmolL，咖啡因 0.8000g/L标准混合液：取各组分标准储备液各 1ml，混合均匀后备用。1.2 样品处理选择市售饮料三种（科力福、醒目、非常甜橙）充分混匀后用虹吸法分层取样，每层各取 50ml 左右，装入小口瓶中混和均匀后超声波除气 15min，用 1：9 氨水调节 pH 6.0,经 0.2m 水相滤膜过滤后，备用。科力福:取原样品液用原子水稀释 5 倍后，进行以上操作。1. 3 色谱条件C1
5、8柱颗粒度 10um、柱温 16 摄氏度、检测波长 230nm、流动相甲醇乙酸氨（0.02mol/L）溴化四丁铵(0.007mol/L)配比 35:65:4 ，pH 6.0，流速 1.0ml/min，微量进样器定量进样 20l,实验以保留时间定性，外表物法定量。2 结果与讨论2.1 检测波长选择用紫外可见光分光光度计检测器,检测 9 种物质发现其在 200nm300nm 范围内敏感波长分别为山梨酸 糖精 咖啡因 苯甲酸 胭脂红 苋菜红 柠檬黄 VC 日落黄260nm 202nm 206，273nm229nm 215nm 216nm 257nm 262nm 234nm兼顾九种组分在 200nm3
6、00nm 的紫外吸收值,选择 230nm 为检测波长。2.2 流动相选择实验:以甲醇乙酸氨作为流动相 1对 组分进行分离,如图：（1）甲醇乙酸氨 0.02mol/L =30：70图 1 添加剂组分拟合图胭脂红和苯甲酸分离不开，且六种组分（VC、柠檬黄、日落黄、胭脂红、山梨酸、苯甲酸）出峰时间集中在 2.7min-5.4min 范围内，不易于最终分离测定。（2）甲醇乙酸氨 0.02mol/L=40：60图 2 添加剂组分拟合图柠檬黄与苋菜红，出峰重叠；胭脂红与日落黄，出峰重叠，分离效果不好，且组分峰比较集中，不易分离测定。（3）甲醇乙酸氨 0.02mol/L =44：56图 3 添加剂组分拟合图
7、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄四种物质出峰重叠；苯甲酸、山梨酸出峰干扰，且各组分出峰时间相对集中，不易于最终分离测定。结论：由以上三个图形显示，最佳流动相配比，介于甲醇乙酸氨 0.02mol/L 30：70至甲醇乙酸氨 0.02mol/L 40：60中间的一个配比，经实验摸索最终选择 甲醇乙酸氨0.02mol/L35：65为最佳配比。（4）甲醇乙酸氨 0.02mol/L=35：65图 4 添加剂组分拟合图1-柠檬黄 2-苋菜红 3-日落黄 4-VC 5-胭脂红 6-苯甲酸 7-山梨酸 8-咖啡因由图 4 可知七种组分（1-柠檬黄 2-苋菜红 3-日落黄 5-胭脂红 6-苯甲酸 7-山梨酸 8-
8、咖啡因）基本分离，但是出峰时间接近，易发生干扰。拟解决方案：添加改性剂 2.3 添加改性剂溴化四丁铵，选择最佳添加量。（1）甲醇乙酸氨 (0.02mol/L)溴化四丁铵(0.007mol/L)配比 35：65：4图 5 九种组分分离图由图 5 知，加入改性剂后基本上能将九种物质分离。（2）甲醇乙酸氨 (0.02mol/L)溴化四丁铵(0.008mol/L)配比 35：65：4图 6 九种组分分离图由图 6 知，糖精与苋菜红峰重叠，分离效果不佳。（3）甲醇乙酸氨 (0.02mol/L)溴化四丁铵(0.009mol/L)配比 35：65：4图 7 九种组分分离图由图 7 知，糖精与苋菜红峰重叠且与
9、苯甲酸峰重叠趋势增加结论：添加改性剂-溴化四丁铵 能初步将九种物质分离，原因 2:由于中性条件下(pH=6左右)溴化四丁铵带有正电荷,可以促进带负电荷的日落黄、胭脂红出峰时间增长，从而达到分离组分的要求。溴化四丁铵量不宜过多,否则日落黄与胭脂红峰重叠,糖精、苋菜红、苯甲酸峰重叠,因此远择流动相配比为：甲醇-乙酸氨(0.02mol/L)-溴化四丁铵(0.007mol/L)=35:65:4问题：9 种组分，出峰时间相对比较集中。拟解决方案：调节流动相 pH 值2.4 流动相 pH 值选择pH 值主要决定流动相极性,调节 9 种组分出峰时间,能更好的将 9 种物质分离（1） pH=7 图 8 九种组
10、分分离图由图 8 知，进混合样发现糖精与胭脂红峰重叠且与苯甲酸峰有重叠趋势，日落黄与胭脂红重叠，完全出峰时间 13 分钟（2）pH=6.5图 9 九种组分分离图苋菜红与糖精分离不好,完全出峰时间 14 分钟（3）pH=6 图 10 九种组分分离图苋菜红与糖精基本分离,完全出峰时间 15 分钟（4）pH=5.5图 11 九种组分分离图苋菜红与糖精基本分离,胭脂红与咖啡因重叠,完全出峰时间 18 分钟（5）pH=5 图 12 九种组分分离图苋菜红与糖精分离不开,苯甲酸与日落黄重叠，完全出峰时间 20 分钟结论：考虑到分离效果、检测时间与重现性,选择 pH=6.0，为最佳 pH 值。对以上三个条件综
11、合考虑，流动相最终确定为：甲醇乙酸氨（0.02mol/L）溴化四丁铵(0.007mol/L)配比为 35:65:4， pH=6.02.5 线性关系考察将配制好的以下一系列标准溶液，以 C（g/L）对相应的 (mv)作外标物曲线（表一） ，h得到相应的回归方程及相关系数（表二）：表一C （g/L） 、 （m v）苯甲酸 山梨酸 日落黄 柠檬黄 VCC hC hC hC hC h1 0.61063634110.56073623521.000 1097531.000 2128171.000 2142932 0.35032148300.28042249270.500 54592 0.500012067
12、50.50001131853 0.20351480020.18691579820.333329547 0.333381527 0.3333781484 0.15271172030.14021159820.200023535 0.250068367 0.2500617915 0.122192047 0.112192123 0.200054423 0.2000429056 0.101875741 0.166747039 0.1667371047 0.142929398糖精 胭脂红 苋菜红 咖啡因C hC hC hC h1 0.5000 241437 1.000 112758 0.5000 2887
13、26 0.8000 1560852 0.3333 181938 0.1667 35519 0.3333 218377 0.4000 791843 0.2500 137484 0.1000 2400 0.2500 169867 0.2667 552934 0.1667 114908 0.2000 145554 0.2000 390935 0.1429 79938 0.1600 324716 0.1333 276497 0.1143 22460表 2 线性回归方程、相关系数添加剂 线性回归方程 LRE 相关系数（r）咖啡因 Y=1422.5492+1.939e+005X 0.9997VC Y=30
14、62.8391+2.142e+005X 0.9983山梨酸 Y=37100.3956+5.991e+005X 0.9918苯甲酸 Y=26745.0412+5.521e+005X 0.9983糖精 Y=18685.2031+4.612e+005X 0.9941苋菜红 Y=51212.8427+4.813e+005x 0.9974日落黄 Y=-2987.6231+1.128e+005X 0.9954胭脂红 Y=-630.0775+1.185e+005X 0.9698柠檬黄 Y=16334.6903+1.987e+005X 0.9988注：Y：计算机给出的峰高响应值；X:组分质量浓度（g/L）九种
15、组分线形工作曲线图谱 2.6 本方法准确度测试取 科力福、非常甜橙、醒目、绿茶样品，每个样品精确移取 5ml 置于 10ml 离心试管中，按本实验的方法处理及测定(n=3)，以标准样品的测定结果作为本底值，结果见表 4表 4 样品中食品添加剂加标回收率（单位 g/L）非常甜橙食品添加剂本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)苯甲酸 0.4500 0.2035 0.6404 93.56 0.635VC 0.1752 0.1667 0.3327 94.48 0.428日落黄 0.1123 0.1667 0.2687 93.82 0.21科力福(稀释液)食品
16、添加剂本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)山梨酸 0.2250 0.1869 0.4201 104.4 0.2VC 0.1944 0.1667 0.3532 95.26 0.733柠檬黄 0.4240 0.1667 0.5553 78.76 0.31醒目食品添加剂本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)苯甲酸 0.1725 0.2035 0.3580 91.15 0.393VC 0.034 0.0834 0.1071 87.64 0.55绿茶本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)咖啡因 0.125 0.1143 0.2303 92.12 0.8472.7 样品的测定结果四种饮料按本实验的色谱条件进样分析，得到四种样品的
