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1、实验室常用技术参数资料一、核酸及蛋白质常用数据 1核苷三磷酸的物理常数化合物分子量max(pH7.0)1 摩尔溶液（pH7.0 ）中 max 时的最大吸收值OD280/OD260ATP 507 259 15400 0.15CTP 483 271 9000 0.97GTP 523 253 13700 0.66UTP 484 262 10000 0.38dATP 494 259 15200 0.15dCTP 467 271 9300 0.98dGTP 507 253 13700 0.66dTTP 482 267 9600 0.712常用核酸的长度与分子量核酸 核苷酸数 分子量DNA 48502（双
2、链环状） 3.0107pBR322 4363（双链） 2.810628SrRNA 4800 1.610623SrRNA 3700 1.210618SrRNA 1900 6.110519SrRNA 1700 5.51055SrRNA 120 3.6104tRNA（大肠杆菌） 75 2.51043常用核酸蛋白换算数据（1）重量换算1g=10 -6g 1pg=10-12g1ng=10 -9g 1fg=10 -15g（2）分光光度换算：1A 260 双链 DNA=50g/ml1A 260 单链 DNA=30g/ml1A 260 单链 RNA=40g/ml（3）DNA 摩尔换算：1g 100bp DNA
3、=1.52pmol=3.03pmol 末端1g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp DNA=0.66g1pmol pBR322=2.8g1kb 双链 DNA（钠盐）=6.610 5 道尔顿1kb 单链 DNA（钠盐）=3.310 5 道尔顿1kb 单链 RNA（钠盐）=3.410 5 道尔顿（4）蛋白摩尔换算：100pmol 分子量 100，000 蛋白质=10g100pmol 分子量 50，000 蛋白质=5g100pmol 分子量 10，000 蛋白质=1g氨基酸的平均分子量=126.7 道尔顿（5）蛋白质/DNA 换算：1kb DNA=333 个氨基酸编码容量
4、=3.710 4MW 蛋白质10，000MW 蛋白质=270bp DNA30，000MW 蛋白质=810bp DNA50，000MW 蛋白质=1.35kb100，000MW 蛋白质=2.7kb DNA4常用蛋白质分子量标准参照物（1）高分子量标准参照 （2）中分子量标准参照 （3）低分子量标准参照肌球蛋白 分子量 磷酸化酶 B 97，400 碳酸酐酶 31，00肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500-半乳糖甘酶 B 116，000 谷氨酶脱氢酶 55，000 抑制剂 磷酸化酶 B 97，400 卵白蛋白 42，700 马心肌球蛋白 16，900牛血清白
5、蛋白 66，200 醛缩酶 40，000 溶菌酶 14，400过氧化氢酶 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1） 8，100醛缩酶 40，000 大豆脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2） 6，200抑制剂 肌球蛋白（F3） 2，500溶菌酶 14，400 5常用 DNA 分子量标准参照物DNA/Hind DNA/EcoR /Hind+EcoR pBR322/Hae23130 21226 21227 587 1239416 7421 5148 405 1046557 5804 4973 504 894361 5643 4268 458 802322 4843 3530 434
6、 642027 3530 2027 267 57564 1904 234 51125 1584 213 211375 192 18974 184 11831 124 7564 125 续上表pBR322/Hinf 174/Hinf 174/Hae 174/Tap1631 726 140 1353 2914517 713 118 1078 1175506 553 100 872 404396 500 82 603 327344 417 66 310 231298 413 48 281 141221 311 42 271 87220 249 40 234 54154 200 24 194 3375
7、 151 118 20 72 二、常用缓冲液1分子克隆常用缓冲液2磷酸缓冲液（1）25下 0.1mol/L 磷酸钾缓冲液的配制 pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml)5.8 8.5 91.56.0 13.2 86.86.2 19.2 80.86.4 27.8 72.26.6 38.1 61.96.8 49.7 50.37.0 61.5 38.57.2 71.7 28.37.4 80.2 19.87.6 86.6 13.47.8 90.8 9.28.0 94.0 6.2（2）25下 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液的配制 pH 1mol/L Na2HPO4(m
8、l) 1mol/L NaH2PO4(ml)5.8 7.9 92.16.0 12.0 88.06.2 17.8 82.26.4 25.5 74.56.6 35.2 64.86.8 46.3 53.77.0 57.7 42.37.2 68.4 31.67.4 77.4 22.67.6 84.5 15.57.8 89.6 10.48.0 93.2 6.8:用蒸馏水将混合的两种 1mol/L 贮存液稀释至 1000ml，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH值：pH=pK+1g(质子受体/质子供体)在此，pK=6.86(25)。3电泳缓冲液测序凝胶加样缓冲液98%去离子甲酰
9、胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025%二甲苯青 FF0.025%溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与 Dowex XG8 混合床树脂共同搅拌 1 小时进行去离子处理，并用 Whatman 1 号滤纸过滤 2 次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70 。常用的电泳缓冲液缓冲液 使用液 浓贮存液（每升）Tris-乙酸 （TAE ） 1：0.04mol/L Tris-乙酸 50：242g Tris 碱0.001mol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8
10、.0)Tris-磷酸 （TPE） 1:0.09mol/L Tris-磷酸 10:10g Tris 碱0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸 （TBE ） a 0.50.045mol/L Tris-硼酸 5：54g Tris 碱0.001mol/L EDTA 27.5 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液 b 1:50mmol/L NaOH 1:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸
11、 c 1:25mmol/L Tris 5:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级 )说明：TBE 溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存 5溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以 1TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但 0.5的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以 1：10 稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用 1TBE 以提供足够的缓冲容量。碱性电泳
12、缓冲液应现用现配。Tris- 甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。2SDS 凝胶加样缓冲液：100mmol/L TrisHCl(6.8)200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）4%SDS（电泳级）0.2%溴酚蓝20%甘油不含 DTT 的 2SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取 1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。4凝胶加样缓冲液缓冲液类型 6缓冲液 贮存温度0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青 FF40%（W/V）蔗糖水溶液40.25 溴酚蓝0.25%二甲苯青 FF15%聚蔗糖(Ficoll400)室温0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 FF 430%甘油水溶液0.25
13、%溴酚蓝 40%(W/V)蔗糖水溶液 4碱性加样缓冲液:300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖(Ficoll400)0.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青 FF4使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青 FF 的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以 0.5TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同
14、。在琼脂糖浓度为 0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。5各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制所需 pH 值（25） 0.1mol/L HCl 的体积71 45772 44773 43474 42075 40376 38577 36678 34579 32080 2928.1 26.28.2 22.98.3 19.98.4 17.28.5 14.78.6 12.48.7 10.38.8 8.58
15、.9 7.0某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml（2）温度对 50mmol/L TrisHCl 液 pH 值的影响4 25 3781 75 7282 76 7383 77 7484 78 7585 79 7686 80 7787 81 7888 82 7989 83 8090 84 8191 85 8292 86 8393 87 8494 88 85（6）常用缓冲液的 pKa 值缓冲液 分子量 pKa 值 缓冲范围Trisa 12.1 8.08 7.17.9HEPESb 283.3 7.47 7.28.2MPOSc 209.3 7.15 6.67.8PIPESd 304.3 6.76 6.27.3MESe 195.2 6.09 5.46.8a ：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N-双（2-乙磺酸）哌嗪；e ：2-（N-吗啉代）乙磺酸。7温度对常用缓冲液 pH 的影响缓冲体系 pKa(20) pKa/10M
