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1、1Smad4 在白血病细胞中表达的初步研究作者：张琰，曹旭，江明，哈力代，温丙昭，李玲，刘辉，钟笛，林仁勇，卢晓梅，冯晓辉，温浩【摘要 】 TGF- 信号的缺失与许多组织的恶性增生有关，Smad4 是该通路的重要蛋白，其缺失或突变与多种癌症相关。本研究目的主要是探讨细胞浆信息传递介质 Smad4 在白血病细胞中的定位及表达。分离白血病病人骨髓单个核细胞，镜下鉴定白血病细胞数量达 90%以上，应用免疫组织化学技术检测白血病细胞中Smad4 蛋白的表达。结果表明： Smad4 蛋白主要表达于细胞核中，部分表达于胞浆中，35 例白血病病人中 6 例急性淋巴细胞性白血病患者 Smad4 无表达，包括
2、L1 1 例，L3 1 例，L2 4 例；7 例急性非淋巴细胞性白血病（1 例 M0，1 例 M1，2 例 M2a，1 例 M3a，1例 M4b，1 例 M6）和 1 例慢性粒细胞性白血病患者白血病细胞中也无 Smad4 表达，其余病人白血病细胞中均表达 Smad4。结论： Smad4 主要定位于细胞核中，在部分白血病细胞中无表达，Smad4 基因或功能的改变可能与人类 AML 的发生有关。 【关键词】 生长转化因子 ； Smad4 蛋白； 急性白血病； 白2血病细胞xpression of Smad4 in Leukemia CellsAbstract Loss of transformin
3、g growth factor (TGF)- signaling has been implicated in malignant transformation of various tissues. Smad4 plays a central role in the signal transduction of TGF-. Deletion or mutation of Smad4 has been described in a number of cancers. This study was aimed to investigate a potential role of Smad4 i
4、n leukemia including its expression and location in blast cells. The mononuclear cells were separated from bone marrow of leukemia patients. The samples，blast cells of which were more than 90% in mononuclear cells，were selected. The expression and location of Smad4 protein were analyzed by immunohis
5、tochemistry methods. The results showed that the Smad4 protein located mainly in nucleus，part of this protein located in cytoplasma，the expressions of Smad4 were not detected in 6 out of 9 ALL patients，in 7 out of 24 AML patients and in 1 out of 2 CML patients; these leukemia patients，in whose cells
6、 the expression of Smad4 was not detected，included one L1 and one L3，four L2，one 3M0，one M1，two M2a，one M3a，one M4b，one M6 and one CML. In conclusion，the Smad4 protein was mainly in nucleus， the deletion or functional change of Smad4 may related with the pathogenesis of human AML.Key words transform
7、ing growth factor-; Smad4 protein; acute leukemia; leukemic cellSmad 蛋白家族是近年来发现的新的细胞内信号转导蛋白，它在 TGF- 超家族成员的信号转导中具有重要的作用，其中Smad4 在 TGF- 超家族各个细胞因子的信号转导途径中都是必不可少的，它参与 TGF- 超家族所有成员的细胞内信号转导过程1 。Smad4 最早被认为是一种肿瘤抑制因子，它的缺失或突变与许多癌症相关，包括胰腺癌、乳癌和大肠癌2， 3 。急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是髓系来源的白血病细胞的恶性增生而最终导致
8、正常造血系统受到抑制的疾病4 ，其原因至今还不清楚5-7 。TGF- 是造血细胞增殖的负向调控因子，它从多种途径抑制造血细胞的生成8 。因此， TGF- 对造血系统的抑制作用一旦被打破，可能更有利于 AML 细胞的增生。由于 Smad4的改变会影响 TGF- 的信号转导，因此本研究检测不同白血病细胞中 Smad4 的表达情况，旨在探讨 Smad4 蛋白在白血病发病中的作用。4材料和方法标本来源35 例白血病骨髓标本来自 2002-2004 年在新疆医科大学第一附属医院血液科住院的患者。患者经实验室骨髓形态学及免疫分型检测有准确的 FAB 分型诊断结果（表 1） 。采用的标准为：骨髓白血病细胞均
9、达 70%以上，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后白血病细胞占 90%以上。骨髓标本按常规细胞冻存方法保存于液氮中。正常对照来自我院门诊体检健康者。Table . Smad4 expression in patients with leukemias by immunohistochemical method（略）试剂及仪器Smad4 小鼠单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司，淋巴细胞分离液购自美国 Sigma 公司，AEC 显色剂及 DAB 显色试剂盒均为武汉博士德公司产品。A70 型显微镜系统为日本 Olympus 公司产品，显微图象分析采用 Metamorph 软件（美国 UIC
10、公司产品） 。5Smad4 在白血病细胞内的定位及表达的免疫组织化学检测采集白血病病人骨髓血 3-4 ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，显微镜下计数，选取单个核细胞分离后白血病细胞百分比大于 90%的标本，细胞涂片，丙酮固定，梯度乙醇脱水，用蒸馏水冲洗 2 遍；放于 3% H2O2 中并在室温下浸泡 10 分钟，滴加Smad4 抗体（抗体按 1400 稀释） ，37静置 1 小时，用 PBS 冲洗 3 遍，每次 5 分钟，滴加二抗，室温下反应 30 分钟，用 PBS 洗3 遍，AEC 或 DAB 显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片。阳性染色为棕黄色，阴性染色为蓝色。结果Smad
11、4 蛋白主要表达于细胞核中。本实验的正常对照细胞中的 Smad4 主要表达于细胞核中，部分胞浆中也有少量表达（附图A，B ） 。白血病细胞中的 Smad4 也以胞核表达为主。共收集符合标准的 9 例急性淋巴细胞性白血病（ ALL） ，其中有 6 例（67%）胞浆和胞核中未表达 Smad4 蛋白（附表和附图 C，D） ，24 例急性非淋巴细胞性白血病（AML）中有 7 例（29%）未表达 Smad4 蛋白，包括 1 例 M0，1 例 M1，2 例 M2a，1 例 M3a，1 例 M4b，1 例M6（附图 F-I） ； 2 例慢性粒细胞性白血病中 1 例未表达Smad4（附图 J） 。6讨论TGF
12、- 调控细胞的增生、分化、凋亡等多种过程9 ，它在肿瘤的发展过程中起重要作用，TGF- 信号通路被认为是肿瘤的抑制性通路。Smad4 相对分子量为 60 kD 左右，存在与人类染色体18q21，1，由 11 个外显子组成。它是 TGF- 超家族成员信息传递必需的中心转导分子，对细胞增殖具有重要调控作用10 。我们的研究结果提示：在正常人的细胞中，Smad4 主要表达于细胞核中，细胞浆中也有少量表达，大部分白血病细胞 Smad4 的表达与正常细胞相似。因此，Smad4 在白血病细胞中主要定位于细胞核。同时，在 9 例 ALL 病例中，有 6 例无 Smad4 的表达，分别为 1 例 L1， 1
13、例 L3， 4 例 L2；23 例 AML 中 7 例急性非淋巴细胞性白血病（1 例 M0，1 例 M1，2 例 M2a，1 例 M3a，1 例M4b，1 例 M6）和 1 例慢性粒细胞性白血病患者白血病细胞中均未见 Smad4 的表达，其原因可能是： 丝氨酸依赖性的裂解活性导致 Smad4 的体外降解，但有关降解机制还不明确11 ；Smad4 序列中存在突变。Yoichi 等12发现，AML 病人中的两种 Smad4 突变，1 种是由错义突变导致的 MH1 结构域单个氨基酸的改变，另一种是 CTV-1 细胞系（源于急性单核细胞性白血病的细胞系）中的 MH2 结构域羧基末端框移突变。这两种突变
14、最终使Smad4 失去了促进靶基因翻译的作用，而且它们可能抑制野生型7Smad4 结合 DNA 的能力，或者可能抑制野生型 Smad4 向核内转移的过程。因此，我们的研究提示 Smad4 基因或功能的改变可能与人类 AML 的发生有关。 Smad4 在造血系统的 TGF- 信号传递过程中有重要作用，它的缺失将导致信号传递受阻。本研究结果从一定角度提示：阻断 TGF- 信号通路可能导致急性白血病的发生。在对 Smad 家族其他成员的研究中，Wolfraim 等13研究认为，Smad3 在 T 淋巴细胞性白血病中是一重要的抑癌基因，在有的病人体内其 mRNA 水平表达正常，但有的病人同样出现了 S
15、mad3蛋白的缺失。Smad3 单独不会引发白血病，但若协同其他因素如P27Kip 细胞依赖激酶抑制因子的改变，则会诱发白血病。可见，Smad 家族在白血病的发生发展中起重要作用。它们的改变直接影响了 TGF- 信号通路。我们发现，Smad4 在一些白血病中表达缺失，这为今后进一步研究 Smad 家族成员在白血病中的作用奠定了基础。【参考文献】1 Heldin CH，Miyazono K，ten-Dijike P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature，1997; 390(
16、6659):465-47182 Schutte M，Hruban RH，Hedrick L，et al. DPC4 gene in various tumor types. Cancer Res，1996;56:2527-25303 MacGrogan D，Pegram M，Slamon D，et al. Comparative mutational analysis of DPC4 (Smad4) in prostatic and colorectal carcinomas. Oncogene，1997;15:1111-11144 Tuyt LM，Dokter WH， Vellenga E. Gene expression，biological effects and clinical aspects of lymphokines. Crit Rev Oncol Hematol，1997; 26: 175-21
