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1、1pEGFP-C1/U6 质粒载体介导的表达 MDR1 shRNA 的质粒构建【摘要 】 为了构建 pEGFP-C1/U6载体介导 MDR1短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达的质粒，针对 MDR1的 19碱基大小的片段，分别设计 2对寡核苷酸，形成双链后将其依次连入带有 U6启动子的 pEGFP-C1载体(命名为 pEGFP-C1/U6)，两对DNA双链连接后形成中间由 9个碱基序列间隔的反向互补序列，构建成能产生 MDR1短发卡 RNA的质粒。结果表明：经酶切、连接后构建成的质粒（pEGFP-C1/U6/A 和 pEGFP-C1/U6/B） ，经酶切与测序证实
2、构建成功，无任何碱基突变。结论：成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒载体 pEGFP-C1/U6/A和 pEGFP-C1/U6/B，此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。 【关键词】 pEGFP-C1/U6载体Construction of pEGFP-C1/U6-Mediated Plasmid Expressing MDR1 shRNAAbstract To construct a plasmid expressing MDR1 2short hairpin RNA (shRNA) mediated by pEGFP-C1/U6 vector， two codi
3、ng sequences of 19 nucleotides were selected from MDR.Two pairs of oligonucleotides were designed for these two fragments.After annealing the formed double-stranded DNAs were ligated with plasmid pEGFP-C1/U6 (pEGFP-C1 vector with U6 promoter).The plasmids producing MDR1 shRNA were constructed from t
4、he inverted motif containing 9 spacers and four Ts. The results showed that the constructed plasmids were named pEGFP-C1/U6/A and pEGFP-C1/U6/B，and the constructs were identified by restriction and sequence analysis，no any base mutation was observed. It is concluded that plasmids of pEGFP-C1/U6/A an
5、d pEGFP-C1/U6/B expressing MDR1 shRNA were successfully constructed， providing a highly effective method for reversing the multidrug resistance in clinic.Key words pEGFP-C1/U6 vector; MDR1 shRNA; plasmid随着肿瘤治疗模式的改变，化疗在肿瘤病人综合治疗中的地位显得越来越重要，它在提高肿瘤病人近期和远期疗效中发挥着切实的作用。但在临床上，病人对化疗的反应可能是暂时或者不彻底的，3肿瘤对药物内在或获得
6、性耐药性，是最终导致肿瘤化疗失败的一个重要原因。产生耐药的肿瘤细胞对结构和功能上截然不同的药物表现出耐受性，即为多药耐药性(multidrug resistance，MDR)。在 MDR的多种机制中，研究最为深入的是 Pgp/mdr1介导的MDR。P-gp 属于 ATP结合的盒式运输蛋白超家族成员，由定位于7号染色体长臂(7q21.1) 的 mdr1基因编码 1 ，是分子量为 170 kD的细胞膜蛋白。 P-gp能够运输多种结构不同的底物，当药物进入浆膜后，P-gp 与之结合，由此引起一个 ATP结合区的活化，水解 ATP，P-gp 构象改变，将药物释放到细胞外2 ，3 。MDR1 的基因表达
7、的下调，对于增强白血病化疗的敏感性具有很好的临床意义4，5 。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它将与目的基因同源的含 21-23个核苷酸的小分子干扰 RNA片段（small interfering RNA，siRNA）转染至靶细胞，与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC） ，RISC 以 siRNA为模板特异地识别其同源基因 mRNA并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的 mRNA降解，从而抑制基因表达6 。本研究构建一种在 U6启动子控制下
8、能产生短发卡状 MDR1 4RNA的载体质粒，小 RNA能在 RNA多聚酶 (Pol)启动子的控制下从 DNA模板合成，RNA Pol能介导 3端以 4-5个结尾的小的、非编码的转录本的合成。拟用此载体质粒转染培养的K562/A02细胞，观察该质粒对其 MDR1表达的抑制作用。材料和方法主要试剂真核表达载体 pEGFP-C1购自美国 Becton Dickinson公司，pEGFP-C1/U6载体由中山大学药学院陈杰博士赠送。质粒抽提试剂盒购自 Qiagen公司， E.coli DH 5菌种由中南大学遗传学国家重点实验室提供。逆转录试剂盒购自 Promega公司，TRIzoL 试剂购自 Inv
9、itrogen公司，限制性内切酶 BamH、SalI、PstI 、T4 DNA Ligase、T4 Polynucleotide Kinase、Hind 、Taq 酶等均购自宝生生物工程有限公司；寡核苷酸、引物由上海博亚生物技术有限公司(Bioasia)合成，Lambda DNA/Hind Marker购自华美生物工程公司，DNA Marker DL2000购自宝生生物工程有限公司。方法5在人 MDR1基因（AF016535）编码区中选择 2个靶序列，其一为 5-GACAGAAAGCTTAGTACCA-3位于 cds2151-2169 bp(序列 A)，其二为 5-CTTTGGCTGCCATC
10、ATCCA-3位于 cds 283-301 bp(序列 )，GC 含量在 50%左右，不含有 4个或 4个以上的。对 2个靶序列进行同源性分析 (BLAST)，以确保其与其他的基因无同源性。针对每一靶序列设计 2对寡核苷酸， 5端带有BamH酶切位点，3端带有 Hind 酶切位点。针对序列 A设计的 2对寡核苷酸为: oligo1-1: 5-GATCCGACAGAAAGCTTAGTACCAT TCAAGACGTGGTACTAAGCTTTCTGTCTTTTTTGT CGACA-3；oligo1-2: 5-AGCTTGTCGACAAAAAAGACAGAAA GCTTAGTACCACGTCTTGAA
11、TGGTACTAAGCTTT CTGTCG-3针对序列 B设计的 2对寡核苷酸为: oligo2-1: 5-GATCCGCTTTGGCTGCCATCATCCAT TCAAGACGTGGATGATGGCAGCCAAAGTTTTTTG TCGACA-3；oligo2-2: 5-AGCTTGTCGACAAAAAACTTTGGCT GCCATCATCCACGTCTTGAATGGATGATGG CA-GCCAAAGCG-3单链目的基因片段的退火形成双链，命名为 A和 B。继而将6A和 B双链退火片段磷酸化。pEGFP-C1/U6 载体（将人 U6启动子与去掉 CMV的 pEGFP-C1连接后形成的质粒，
12、由中山大学药学院陈杰博士赠送）BamH+ Hind双酶切，1琼脂糖凝胶回收大片段。磷酸化退火片段 A和 B分别与线性化 pEGFP-C1/U6载体连接。各取 5 l连接产物转化感受态细胞 E.coli DH5，涂布于含Kanar抗性的 LB平板上，37 恒温培养过夜。从每个培养皿上各挑取 3个单菌落接种于 3 ml含 Kanar抗性的 LB培养液中，37恒温摇床培养过夜。用试剂盒小量提取质粒，并做 Pst和 Sal酶切鉴定。质粒 pEGFP-C1/U6具有 Pst酶切位点，能被 Pst所酶切，而插入目的基因片段之后，PstI 酶切位点被取带，故不能被PstI所酶切。其 pEGFP-C1/U6载
13、体的 MCS为：-Hind-Xba-Sal-Pst-BamH-U6 Promotor-EcoR-Sal-Xba-Dra 。在插入的目的基因片段里，设计一个 Sal的酶切位点，插入在质粒 pEGFP-C1/U6的 BamH和 Hind 之间，如若插入正确，就能被 Sal酶切出一条约 400 bp的小带。经酶切分析，质粒符合设计要求。送转化菌液测序，测序引物序列为 Forward:5-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3Reverse:5-CTACCAGGACGA CCTCAAGCAC-3。经测序，结果完全符合设计要求。用 Tip 500大量抽提质粒备转细胞用。结果pEGFP-C1/U
14、6质粒图谱7质粒大小为 4 900 bp。pEGFP-C1/U6 质粒图谱见图 1。质粒 pEGFP-C1/U6上有 BamHI和 Hind酶切位点。环状质粒呈线性化。未酶切质粒为环状质粒，可见多重构象（图 2） 。目的片段酶切鉴定用 Pst 和 Sal酶切已接入 A和 B的 pEGFP-C1/U6环状质粒，产物经琼脂糖凝胶电泳结果见图 3。图中分别可见 4 500 bp及 400 bp左右两个条带。连接成功时酶切片段大小为 4 500 bp和 300 bp，连接不成功片段大小为 4 900 bp左右。测序分析pEGFP-C1/U6/A和 pEGFP-C1/U6/B质粒构建部分测序结果证实 p
15、EGFP-C1/U6/A和 pEGFP-C1/U6/B质粒构建正确，序列无突变。讨 论近年来的研究表明，一些小的双链 RNA可以高效、特异地8阻断体内特定基因的表达，促使 mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为 RNA干扰(RNAi)。它也是体内抑制外在感染的一种重要保护机制。由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，RNAi 正在功能基因组学领域和基因治疗领域掀起一场真正的革命。在较早的哺乳动物 RNAi实验中，siRNA 是通过化学方法合成的，研究者先后用 RNAi技术在线虫、果蝇、动植物卵细胞及哺乳类细胞中进行了大量研究7-9 。但是鉴于化学合成 siRNA费用高
16、，容易降解并仅瞬时表达持续 1周时间，转染效率低等，对基因功能的研究有一定的限制。属于 RAN聚合酶类的 U6启动子可转录产生小发卡 RNA(short hairpin RNA，shRNA)，即转录产生一段含有 RNA正义链、环（ loop）和反义链的小发卡 RNA。若向细胞中导入 U6干扰质粒( 由 U6启动子与被干扰基因的发卡样短片段摸板组成)，则由此介导的 RNA干扰可较好地克服以上缺点10-12 。在构建双链 RNA的表达载体时，使用 RNA多聚酶来指导RNA的合成。应用聚合酶 系统的关键优势在于转录过程被 TTTTT准确终止（在 RNA中是 UUUUU） ，在 RNA3末端留有 1-4个U。有聚合酶 III启动子和 shRNA 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达 siRNA的质粒可以下调特定基因的表达，抑制范围包括外源
