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1、堑l江 型 ! 至 箜 鲞笙4期ZH J J Traumatic，August 2010，vo115，No4 439 基础研究 神经肽在神经化组织工程骨中表达的早期实验研究 姚旺祥 马 安 裴国献 随着骨组织工程研究深入以及向临床过渡的逐 渐展开，一个主要的问题就是如何构建大块组织工 程骨在体内存活并发挥功能作用。而神经系统在骨 中的分布与功能的研究深入，为神经因素融人到组 织工程骨的构建中来提供了理论依据和经验。临床 常用神经植入方法来重建受区的神经支配，笔者利 用显微外科技术，将感觉神经、运动神经及两者联合 植入大段组织工程骨中，从组织学上分析植入神经 对组织工程骨早期成骨的影响，并利用降
2、钙素基因 相关肽(Caleitonin gene related peptideCGRP)的免疫 组化染色来初步观察其促进成骨的机制 1材料与方法 11动物模型与实验分组：新西兰大白兔48只(购 自南方医院实验动物中心)，体质量2025kg，6个 月龄，雌雄不限。抽取自体骨髓，体外扩增骨髓基质 干细胞。取第4代骨髓基质干细胞按6106-8x10 个 ml的密度接种到直径8ram、带侧槽的、多孔B一磷酸 三钙(购自武汉华威公司)支架上构建组织丁程骨， 体外培养7d后备用。实验动物随机分为4组：A组， 单纯组织工程骨组；B组，组织工程骨+运动神经束植 入组；C组，组织工程骨+感觉神经束植入组；D组
3、，组 织工程骨+感觉、运动神经束联合植入组。 12神经植入组织工程骨动物模型的制备：参照本 课题组的做法l J1所有动物均于右侧后肢股骨前外侧 做一纵形切口，长约7cm，切开深筋脉，从肌间隙内分 离显露股骨。于股骨前侧放置已塑形好的4孔普通 钢板，于钢板第2、3孔之间以手外科钢锯截取15cm 长股骨与骨膜缺损于缺损处嵌入组织工程骨后穿 两条一号线备用，再依次缝合伤口。再在股骨内侧正 中做一长约5cm的纵切口，逐层切开，暴露深筋膜， 即在股三角内可见大隐神经f兔大隐神经为股神经的 延续，与股血管伴行1，游离适当长度后将大隐神经锐 性切断，将近端神经作束间适当分离，通过内侧肌间 隙成爪状尽量多的植
4、入组织工程骨内两股丝线将 作者单位：310006杭州，浙江省杭州市第一人民医院 其固定在侧槽内，为感觉神经植入组。切开股内侧 肌，可见由股神经发出的支配股内侧肌的肌支，游离 一段长度后切断，通过内侧肌间隙将此神经束植入 组织工程骨的侧槽内，为运动神经植入组：将两者联 合植人为感觉、运动神经束联合植入组。仅仅分离出 感觉、运动神经束而不切断者为对照组。生理盐水冲 洗伤口后逐层缝合，包扎切口。术后每天肌注青霉素 40万U。连续3天 13观察指标 131大体标本观察：各组分别于术后第4周、8周、 12周各处死4只动物。完整截取骨缺损侧股骨，观察 骨缺损区新骨形成情况、与宿主骨界面结合情况及 周围软组
5、织反应。 1-32组织学切片观察：对骨缺损区组织以4OgL的 多聚甲醛固定，150gL的乙二胺四乙酸脱钙后石蜡 包埋，连续横行及纵行切片，厚度5 m，行HE及 MASSON染色。每只动物取3张横行间断切片在100 倍光镜下观察新骨形成情况。每张切片随机取5个 视野，分析新生骨小梁面积象素值，并计算其占视野 总面积象素值的百分数。 133 免疫组织化学染色：多克隆羊抗兔降钙素基 因相关肽(Caleitonin gene related peptide，CGRP)抗体 及过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(Chemican公司)。采 用SABC法用已知CGRP阳性表达的切片做阳性对 照，PBS液分别代替
6、一抗、二抗及SABC液作阴性对 照。图像分析测定染色的灰度值，再计算出每张切片 的平均灰度值(平均灰度值与免疫表达强度呈反比)。 14数据处理：所有参数采用SPSS100统计软件检 验均呈正态分布，同一时间不同组标本的新生骨组 织在骨缺损区域所占面积、免疫组化各组平均灰度 值检测数据的比较均采用单因素方差分析，以P O05为有统计学意义，若差异有统计学意义再用 SNK法行多重比较。 2 结果 所有动物术后饮食正常，有2只动物f一只为A 440 浙江创伤外科2010年8月第15卷第4期ZH J J Traumatic，August 2010，Vo115，No4 组一只为C组)于手术后1周内死于腹
7、泻，再次手术 补齐实验所需其余动物手术切口无红肿及渗液，I 期愈合。 21 大体标本观察：术后4周时A组与B组标本在 两接触面及材料表面均被结缔组织包裹，材料与骨 接触面能折动而C组与D组标本材料表面为薄层 软骨样与纤维样骨痂包裹，两断端问能轻微折动。术 后8周时A组与B组标本表面为少量骨痂与纤维组 织组成，而C组与D组标本材料表面均为薄层骨痂 包裹，较硬，两断面与骨连接处较模糊，不易分辨。术 后12周时A组与B组标本在两断端形成少量的骨 性连接，表面被骨痂与骨质包裹，C组与D组标本材 料表面各面均为皮质骨样组织包裹或替代。两断端 分界面已不可见。 22组织学观察及评分结果：随着时间的推延，各
8、组 支架材料均有不同程度的吸收在各时间点C组与 D组均较A组与B组明显。其中，A组与B组支架材 料在术后4周时未见明显降解，材料边缘可见较多 炎症细胞侵润；而C组与D组标本的材料部分降解 为颗粒样物质，降解的空间为新生骨组织代替Mas son染色显示其内所含的胶原成分多为未成熟胶原 组织(成熟的胶原组织有钙沉积，Masson染色中被 染成红色，而不成熟的胶原组织缺少钙盐沉积被染 成绿色)，骨小梁周围有成骨细胞排列整齐部分新 生骨中可见小血管样结构。8周时A组与B组材料 部分降解，形成少量新生骨，排列紊乱。而C组与 D组标本有较多骨小梁形成新生骨中可见灶状骨 髓形成，有大量血管形成。12周时A组
9、与B组可 见较多骨痂形成，但材料仍有大半未降解，而C组 与D组标本为较成熟排列整齐的骨组织，仅材料 中间有一些未降解的材料碎屑。对植人物区新生 骨组织评分结果显示各时间点C组与D组间均优 于A组与B组间，差异有统计学意义(P005)，A组与B组间差异 无统计学意义(P005)。 2-3免疫组织化学观察结果：C组 与D组：1月时均可见少量CGRP 呈点状分布在新生骨边缘及新生 骨与未降解材料交界处；2月时， 见CGRP表达增多，在整个新生骨 内均匀分布，多见于新生血管与灶 状骨髓周围，但不局限于其周围，且此时可见新生骨 边缘及骨膜处分布最多；3月时的观察与2月时所见 无明显区别。A组与B组：前2
10、月均未见CGRP的表 达，仅在3月时见CGRP弱表达于新生骨的边缘处。 对植人物区新生骨组织内CGRP染色灰度值(表1 2)的统计学分析显示随着时间的延长，各组新生骨 组织内CGRP的表达量都有不同程度的增多。差异 有统计学意义(F=258046，P 005)，A组与B组问差异无统计学意义(P0O5)。 表1 术后各组不同时相骨小梁占骨缺损区域面积百分比 f；sn-4相对值】 表2术后各组新生骨组织内CGRP平均染色灰度值表( 怕。n-4) 注：主效应的F统计量和P值；#交互效应的F统计量和P值。 塑 篁 卷第4 ZH J J Traumatic，August 2010，Vo115，No4 3
11、讨论 31 组织工程骨神经化的临床必要性：骨组织工程 的最终发展方向就是服务于临床，为临床常见而又 处理棘手的大段骨缺损修复提供一种切实可行的方 法。兔股骨直径大于桡骨直径，故本实验采用的兔股 骨缺损来制造大段骨缺损，前期的研究表明15cm长 不能自行愈合rII，且以利用钢板固定而更接近临床实 践。本实验构建的组织工程骨长15cm、直径8mm，单 纯依靠周围的组织渗透来提供足够的养分是不够 的。且课题组早期的研究发现，单纯大段组织工程骨 植人体内后，材料中心的细胞因得不到营养而死亡 影响成骨，提示必须为大段组织工程骨提供足够的 营养才能实现高质量的成骨。神经系统作为机体广 泛存在的一种调节系统
12、，通过全身与局部等多种方 式调节骨的生长与成熟21。利用仿生学的观点，临床 常用感觉神经植人皮瓣的方法重建无感觉皮肤的感 觉功能I 3I。受其启发，笔者将神经植入组织工程骨，观 察能否在成骨的同时重建组织工程骨的神经支配。 从而在体内促进成骨。 32感觉神经促进组织工程骨成骨：本实验通过对 新生骨的组织学定量分析发现感觉神经植入在各时 间点都能促进组织工程骨成骨，而植入运动神经却 无明显促进作用。骨的神经支配主要由分布于骨膜 的感觉神经与分布在滋养血管壁的自主神经支配， 主要调节骨的感觉与血运。现有研究表明，骨组织内 的神经纤维多为肽能神经通过分泌神经多肽对骨 代谢产生重要的调节作用，而成骨细
13、胞及破骨细胞 上有多种神经肽受体。神经肽在骨内以旁分泌方式 作用于成骨细胞上的高亲和力的受体。通过调节破骨 细胞和成骨细胞的功能。促进骨形成，抑制骨吸收41。 神经肽从神经末梢释放，在骨组织内局部可形成高 浓度，诱导骨形成f 5_。同样，从人长骨骨干骨折不愈合 标本中观察到骨折处CGRP阳性神经纤维稀疏或 缺失，而在大鼠失神经支配形成的胫骨骨痂中，未见 CCRP免疫阳性神经纤维长入61。 本实验观察到植入感觉神经后，在C组与D组 内可见CGRP随时间的增长而逐渐在新生骨内分泌 增多，且较多分布于不成熟骨组织内，多与新生血管 伴行但不局限于血管周围，说明植入的感觉神经可 以分泌的神经肽，而神经肽
14、类物质能促进新生骨形 成及成熟，这种作用不完全是通过血管化来完成的； Shih C等17证明CGRP可通过刺激干细胞有丝分裂 或骨祖细胞分化来促进骨形成，在不同种属骨源性 成骨细胞培养中发现，CGRP可以明显刺激细胞内环 磷酸腺苷的产生，推测其对骨改建的某些作用，可能 涉及到骨细胞内的糖原代谢。 而在运动神经植入组早期未见明显的CGRP表 达，仅在12周时见少量表达于新生骨边缘。笔者认 为可能是周围组织中向组织工程骨内生长的感觉神 经分泌所致。Bjurholm8I采用神经纤维变性法研究了 骨内神经纤维的性质和功能，提出骨内神经纤维有3 种：一是无髓的交感神经纤维，位于血管周围可收 缩血管，控制
15、血流；二是有髓的感觉神经纤维分布 于血管周围及骨髓；三是分布于骨髓内的无髓神经 纤维，可能与调节造血功能有关，但未见有运动神经 存在的报道。在周围神经系统，CGRP主要存在于C 型和A8型感觉神经末梢I9，通过分泌神经肽来调节 靶器官的内在特性，比如有丝分裂促进活性等。在脊 髓的前角中存在的运动神经元(Q和y运动神经元) 产生放射传出冲动直达所支配的肌肉，主要参与调 节骨骼肌的运动，未发现有神经肽分泌l】01。 另外，影响组织工程骨成熟的最根本因素是局 部血液供应的建立，CGRP同时有刺激血管生成作 用，还可刺激血管内皮细胞增殖，诱导新生血管的生 成：CGRP是迄今为止发现的最强的内源性血管扩
16、张 物质。通过在组织工程骨内的局部扩散，扩张局部血 管增加血运而促进新骨生成l1”。 本课题组前期实验对不同时期胚胎期骨的发育 进行动态观察显示，主要是感觉神经与自主神经分 泌的神经肽类物质表达于骨的生长、成熟各个阶段l】21。 组织工程骨形成的过程与骨的发育过程类似，其局 部微环境可能与感觉神经再生所需的微环境是相适 应的。切断的感觉神经束植入组织工程骨后，神经束 近断端可能通过未损伤或未溃变的神经元，以及侧 芽发生及中枢内自身调节等多种因素来再生轴突， 使轴浆流恢复，新生神经与靶器官结合而参与调节 骨的生长代谢【l3I。而运动神经则不能与靶器官建立联 系而逐渐消失故无明显的促进成骨作用。因观察周 期较短，本实验未能观察到植入神经后对组织工程 骨成骨的中长期效果与最终神经支配的建立情况， 有待进一步的实验来验证。 综上所述，通过感觉神经植入重建大段组织工 程骨的神经支配，可以使组织工程骨及时受到全身 因素的调节
