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1、猪圆环病毒 2 型疫苗最新研究进展猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011 年猪圆环疫苗上市至今，已有 17 家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。1.PCV-2 国内外最新流行动态由 PCV-2 引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起 PMWS 后1，学者通过调查本国包括 SPF 猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪
2、群中 PCV-2 血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中 PCV-2 抗体阳性率分别为86和 92。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在 PMWS。在我国猪群中 PCV-2 感染情况也不容乐观。2000 年郎洪武等2在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等 7 省(市)的 22 个猪群采集了 559 份血清，用 ELISA 方法检测 PCV-2 抗体，其阳性率高达 5l，表明我国猪群中存在 PCV-2 的感染。王忠田等3用 PCR 方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)
3、的 12 个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒 2 型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒 2 型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等4在 2010 年对安徽省 PCV-2 流行病学调查，结果表明安徽省 14 个市(县)的 PCV-2 抗体阳性率平均为 74.36，表明安徽省猪群中普遍存在着 PCV-2 的感染。从上述报道表明 PCV-2 在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中 PCV-2 抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2 与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与 PCV-2 混合感染率达到了 205。陕西省
4、 PCV-2 与 PRV 混合感染率是 21.76 。2005 年陈义祥等对广西地区 197 份组织病料检测发现，PCV-2 与 PRRSV、 CSFV、SIV、PRV 混合感染占总病料数量的 57.73。2003 年王文军等7 对黑龙江地区 PCV-2 阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。哈尔滨兽医研究所刘长明8在 2007 年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA ）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群 480 份血清和发病猪群424 份血清，抗体阳性率分别为 79.2%和 91.7%，表明 PCV-2 在猪群中感染率非常高。山东农科院畜
5、牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实 PCV-2 防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为 34.66%（124/357），2011 年检出率为 25.59%(174/588)；2012 年检出率为21.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。2.PCV-2 病毒特点基因组内存在 11 个潜在 ORFs，即 ORF1-ORF11，其中 ORF1、5、7、10 方向相同,为顺时针方向；ORF2、3、4、6 、8、9、11 方向相同，为逆时针方向PCV-2 全长由 1768 或者 1767 个核苷酸组成，目前出现了新的 1766 个核苷酸的病例
6、9。PCV2 基因型内核苷酸序列非常保守，同源核苷酸的同源性大于 96%。3PCV-2(圆环病毒)毒株流行情况根据对 PCV-2 毒株的序列分析结果，将 PCV-2 病毒分离株分为 5 个亚型(PCV-2a PCV-2e),鉴于 PCV-2a 和 PCV-2e 都有 l768bp 的基因组；因此，又把这几个基因型统称为 PCV-2a，所以PCV-2a 基因型包括 PCV-2a、PCV-2e 等型；而 PCV-2b、PCV-2c 和 PCV-2d 都有 l767bp的基因组，因此，又把这几个基因型统称为 PCV-2b，所以，PCV-2b 基因型包括 PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d 等型
7、。随着时间推移，PCV-2 基因型也有所变异，通过检测分析，世界范围内主要流行 PCV-2 亚型已从 PCV-2a 转化为 PCV-2b(Patterson 等，2010) ，即 PCV-2b 为主要流行亚型，毒力也最强。Li 等(2010)对 2001-2009 年间报道的 136 株 PCV-2 中国株进行了分析，结果表明 PCV-2b 占 127 株，PCV-2a 占 9 株，其中 2001 年中国流行株以 PCV-2a 为主，以后PCV-2b 占绝大部分。2010 年，西北农林科技大学张彦明10也得出类似结论：其对 1999 年2009 年 NCBI 中登录的 556 个 PCV-2
8、分离株全基因序列进行分析。结果表明，1999 年2002 年所登录的 PCV-2的优势流行毒株为基因 a 型(PCV-2a) ；从 2003 年开始基因 b 型(PCV-2b)逐渐为优势流行毒株，在 PCV-2 分离株中基因 b 型所占比例，2004 年为 95.4，2007 年2009 年均超过76.0。2003 年2009 年国内的 PCV-2 分离株有 287 个，其中 250 个为 PCV-2b，37 个为 PCV-2a，表明 PCV-2b 是国内猪群中的主要优势毒株。通过建立 PCV-2a 和 PCV2-b PCR 检测方法，对 70 份临床病料的检测显示，PCV-2 检出率为 34
9、29(2470)，基因型均为 PCV-2b，无PCV-2a 的检出，表明 PCV-2b 为检测猪群中的主要优势毒株。4.疫苗研究进展目前国内外学者对 PCV-2 疫苗的研究主要是从灭活疫苗、构建嵌合病毒、亚单位疫苗、重组腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面进行研究。现在取得新兽药证书的有 20家，其中包括外企 4 家，但在中国注册仅有 1 家，为勃林格，国内企业有文号的有 10 家，马上上市的也有 10 家。合法上市的 17 家圆环疫苗，不包括通过其它渠道进入中国市场的梅里亚、英特威/ 先灵葆雅、富道/硕腾 3 家及易邦的中试产品。这 21 家圆环病毒疫苗产品表现以下特点：按生产方式可分：基因
10、工程疫苗和全病毒灭活疫苗4.1 基因工程疫苗：又可分为基因工程亚单位疫苗和基因嵌合疫苗由于圆环病毒毒力弱，全病毒培养获得高滴度病毒难度大，部分企业采用原核表达和真核表达的方式，通过蛋白纯化浓缩提高抗原水平。勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，用 PCV-2 的 ORF2 基因（Cap 蛋白）插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的 PCV-2 Cap 蛋白，制备亚单位疫苗。而易邦采用 PCV-2 的 ORF2 基因（Cap蛋白）插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达 PCV-2 Cap 蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进
11、行蛋白复性来提高疫苗效果，这个也是为什么国外企业采用真核表达的原因。从工艺上讲，勃林格、英特威/先灵葆雅属于哺乳动物细胞真核表达，而易邦属于原核表达，真核表达对工艺要求是远大于原核表达系统，这和国外企业相比还是有一定差距的。富道/硕腾为 PCV1-PCV2 嵌合疫苗，把 PCV-2 的 ORF2 基因（Cap 蛋白）替换 PCV-1 的 ORF2 基因（ Cap 蛋白），灭活制备基因嵌合体疫苗。4.2 全病毒灭活疫苗4.2 .1 生产工艺由于原核表达与真核表达成本高，而且表达产量有限，对于蛋白纯化要求较高，制约了产品的市场推广。所以更多的是采用全病毒灭活的方式研究疫苗，梅里亚是最早投放市场的全
12、病毒灭活疫苗，但梅里亚圆环疫苗没有在中国注册。关于全病毒灭活疫苗最大的瓶颈在于如何获得高滴度病毒液，所以必须优化工艺，提高滴度，目前，生物制品厂家多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒（通过悬浮培养 GMP 验证的车间很少），这就能克服圆环病毒毒力弱带来活力不强的难题。4.2 .2 毒株目前市场上主要还是全病毒灭活疫苗，主要毒株：SH 株、LG 株、DBN-SX07 株、WH 株、ZJ/c 株之分，但从本质上讲，是没有区别的，因为圆环病毒具有致病性的只有圆环 2 型，而且只有 1 个血清型，这 5 个毒株均属于 PCV-2b，毒株只能表明分离地点以及天然免疫原性而已，笔者在 NCBI 上下
13、载了 PCV-1、PCV-2a、PCV-2b 等参考序列，运用 MEGA 40 进行与疫苗毒株ZJ/C 株、 WH 株、LG 株、 SH 株、DBN-SX07 株等序列进行比对，我们清晰的发现：ZJ/C 株、WH 株处于同一分支； LG 株、SH 株处于同一分支；DBN-SX07 株与 LG 株、SH 株遗传距离更近，这个也与毒株分离早晚有一定关系，LG 株、SH 株疫苗 2011 年上市、DBN-SX07 株疫苗2012 年上市、ZJ/C 株、WH 株 2013 年上市，但这 5 个毒株均处于 1 个大分支，这也说明他们之间的遗传距离比较近，所以，对于圆环病毒这个产品来讲，依据毒株选择疫苗没
14、有多少实际意义，市场宣传毒株只是炒作的噱头而已，关键还是要病毒含量的高度。4.2 .3 病毒含量关于病毒含量，养殖场（户）老板以及技术人员一般对于此项技术参数理解较差，因为病毒含量的表示通常比较抽象，但此项技术指标也是最重要的参数，因此，这里提示各位养殖同仁注意。疫苗的免疫效果与病毒含量成正比，提高疫苗效果最好的方式之一就是增加抗原滴度。目前市场上的疫苗上市时间早晚不一，毒株各异，病毒含量差别也比较大，早期上市的产品病毒含量比较低，但最近上市的无论 ZJ/c 还是 WH 株，病毒含量都达到 107.0TCID50 以上，病毒含量最高的产品甚至是最低产品的 63 倍。对比各个毒株：病毒含量 ZJ
15、/c 株WH 株SH 株LG 株=DBN-SX07 株。用另一种直观表示方式：ZJ/c 株 1 头份=2 头份 WH 株=20 头份 SH 株=63 头份LG 株/DBN-SX07 株。猪圆环病毒含量比较表 4.2 .4 佐剂目前猪圆环病毒疫苗所用佐剂主要有水包油（O/W）、油包水（W/O ）、水包油包水(W/O/W)3 种剂型，水包油（O/W ）佐剂：又称为水质佐剂，和水的吸收性差不多，特点是比较稀。油包水（W/O ）：又称为油类佐剂，特点缓释作用比较强。水包油包水(W/O/W)：又称为双相佐剂，特点介于水包油（O/W）、油包水（W/O）之间。猪圆环病毒疫苗佐剂比较但目前生物制品厂家基本都宣
16、传自家的好，由于圆环病毒毒力较弱，免疫原性较差，而且病毒很难获得高滴度培养，所以在佐剂的选择就显得非常重要，无论是哪种佐剂，都具备增大抗原颗粒，提高免疫原性，缓释作用，持续刺激，延长保护期的作用。所以佐剂的选择也必须考虑到吸收性与缓释性的平衡，所以这个只是厂家宣传显示与众不同的着眼点而已。作为养殖户选择疫苗注意观察两个指标：通针性与保护期，这个两个指标就是针对佐剂吸收好、缓释强的最好诠释。4.2 .5 灭活剂猪圆环病毒是公认的免疫抑制的重要病原，尽管毒力相对较弱，但风险很高，目前基本都是灭活疫苗。灭活疫苗就牵扯到灭活剂的问题，使用灭活剂就要考虑有无残留的问题，如果存在残留，就会出现易致癌性、过敏反应几率高、疫苗反应重等缺点。目前的灭活剂主要有：甲醛、BEI(二乙烯亚胺)、BPL （-丙酰内酯）三种，甲醛最大优势价格便宜，灭活彻底，缺点是易造成残留，而且灭活会损伤病毒的糖蛋白，造成免疫原性下降，BEI 和 BPL，不易残留，不损伤糖蛋白，不影响免疫原性，但存在不易保存、价格
